黃 冰 羅 歡 顏世能 高小堅(jiān) 梁舒靜 蒙 瑤

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧市 530011，電子郵箱：rkhuangbing@163.com.cn)

腎移植是目前臨床上治療終末期腎衰竭的重要方法，而人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)組織配型為腎移植選擇最佳供者提供了重要依據(jù)。有研究表明HLA組織配型對(duì)移植腎的長(zhǎng)期存活起著重要作用，良好的配型可使腎移植患者的10年成活率提高20%，20年成活率提高25%以上[1-3]。1990年美國(guó)器官分配聯(lián)合網(wǎng)制定了應(yīng)用于腎移植的HLA六抗原無錯(cuò)配(zero HLA-A，B，DR，antigen mismatch，0Ag MM)標(biāo)準(zhǔn)[4]，按0Ag MM標(biāo)準(zhǔn)選擇移植供受者的腎臟移植可獲得理想的腎存活率。1996年Terasaki提出了新的配型策略——HLA氨基酸殘基配型(amino acid residue matching，Res M)，又稱交叉反應(yīng)組配型，該配型策略可以提高組織配型的配合率，使其能夠滿足更廣泛的臨床需要[5-6]。1998年我國(guó)譚建明等[7]在Terasaki教授指導(dǎo)下建立了中國(guó)漢族人群Ⅰ類、Ⅱ類Res M配型標(biāo)準(zhǔn)。本文回顧性分析了225例壯族腎移植術(shù)后患者的組織配型資料，旨在比較兩種配型標(biāo)準(zhǔn)在壯族腎移植患者中的應(yīng)用效果。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2005年12月至2017年12月在我院接受腎移植術(shù)的225例患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：受者均為初次腎移植；群體反應(yīng)性抗體陰性；研究對(duì)象及其父輩、祖父輩三代雙親均為壯族；隨訪資料和HLA配型資料均完整；移植供與受者的ABO血型相符，淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)均<5%。排除標(biāo)準(zhǔn)：二次以上腎移植者；群體反應(yīng)性抗體陽性者；三代內(nèi)有民族通婚史者；伴有嚴(yán)重的心肝肺器質(zhì)性病變者。225例患者中男167例，女58例，年齡16～71歲，平均38歲；原發(fā)?。郝阅I小球腎炎132例，IgA腎病34例，糖尿病腎病19例，高血壓腎病22例，其他腎病18例。

1.2 HLA抗原分型方法 HLA-Ⅰ、Ⅱ類抗原分型采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-序列特異性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。采集受檢者靜脈血2 ml并以乙二胺四乙酸抗凝，取200 μl全血用QIAampDNA Blood Mini Kit(德國(guó)QIAGEN公司，生產(chǎn)批號(hào)：20120909-222512、20130706-222419、20141024-222523)提取基因組DNA，DNA純度(A260/A280)值為1.7～2.0。采用HLA-A/B/DR PCR-SSP基因分型試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司，生產(chǎn)批號(hào)：Unitray Lot#003、004、005)進(jìn)行HLA基因分型。操作步驟如下：取270 μl無菌蒸餾水和7.5 μl Taq DNA聚合酶(5 U/μl)加入含580 μl PCR緩沖液的DMix管中，震蕩混勻；取上述混合液8 μl加入分型板的陰性對(duì)照孔，加80 μl全血標(biāo)本至剩余緩沖液管中，震蕩混勻；除陰性孔外，分型板其余每孔分別加入上述混合液8 μl，用密封條密封試劑板后置于PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)程序：96℃ 60 s，1個(gè)循環(huán)；96℃ 25 s，70℃ 50 s，72℃ 45 s，5個(gè)循環(huán)；96℃ 25 s，65℃ 50 s，72℃ 45 s，21個(gè)循環(huán)；96℃ 25 s，55℃ 60 s，72℃ 120 s，4個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增完畢后放4℃冰箱保存。采用1×TAE液配制含0.5 μg/ml溴乙啶的2%瓊脂糖凝膠，取擴(kuò)增PCR產(chǎn)物10 μl在15 V/cm下穩(wěn)壓電泳20 min，紫外燈下觀察結(jié)果；應(yīng)用 SSP 軟件分析基因型別。

1.3 配型結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) (1)按照0Ag MM配型標(biāo)準(zhǔn)[4]評(píng)定：以HLA-A、B、DR此3個(gè)位點(diǎn)6個(gè)抗原分析計(jì)算錯(cuò)配(mismatch，MM)情況，其中6個(gè)抗原全錯(cuò)配為6 MM，5個(gè)抗原錯(cuò)配為5 MM，以下依此類推。分為0～2個(gè)抗原錯(cuò)配(0～2 MM)、3～4個(gè)抗原錯(cuò)配(3～4 MM)、5～6個(gè)抗原錯(cuò)配(5～6 MM)3個(gè)組。(2)參照譚建明等[7]提出的中國(guó)漢族人HLA-Ⅰ、Ⅱ類的ResM標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定：分為0～2個(gè)殘基錯(cuò)配(0～2 MM)和3～4個(gè)殘基錯(cuò)配(3～4 MM)兩個(gè)組，配型標(biāo)準(zhǔn)見表1～2。

表1 HLA-Ⅰ類抗原Res M標(biāo)準(zhǔn)

表2 HLA-Ⅱ類抗原Res M標(biāo)準(zhǔn)

1.4 手術(shù)及術(shù)后處理 患者按常規(guī)方法進(jìn)行腎移植手術(shù)，術(shù)后均給予抗排斥反應(yīng)等常規(guī)治療。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 統(tǒng)計(jì)兩種評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)下的錯(cuò)配情況。

1.5.2 急性排斥反應(yīng)發(fā)生率以及移植腎功能恢復(fù)情況：統(tǒng)計(jì)兩種評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)下腎移植術(shù)后患者的急性排斥反應(yīng)發(fā)生率以及移植腎功能恢復(fù)情況。(1)急性排斥反應(yīng)[8]：腎移植術(shù)后患者出現(xiàn)移植腎區(qū)脹痛、少尿或無尿，B超檢查顯示移植腎略增大，腎皮質(zhì)血流減少，動(dòng)脈血流指數(shù)增高；同時(shí)伴有血肌酐升高、補(bǔ)體水平下降、血小板減少。(2)移植腎功能評(píng)價(jià)[9]：① 移植腎功能立即恢復(fù)：腎移植術(shù)后第5天血肌酐值≤265.2 μmol/L(3 mg/dl)；② 移植腎功能緩慢恢復(fù)：腎移植術(shù)后第5天血肌酐值>265.2 μmol/L(3 mg/dl)，但不需要血液透析；③ 移植腎功能延遲恢復(fù)(delayed graft function，DGF)：腎移植術(shù)后第1周血肌酐值未下降至400 μmol/L者。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)下的HLA配型結(jié)果 按0Ag MM標(biāo)準(zhǔn)配型，達(dá)到0～2 MM 54例(24.0%)、3～4 MM 165例(73.3%)，5～6 MM 6例(2.7%)；按Res M標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到0～2 MM 81例(36.0%)、3～4 MM 144例(64.0%)。兩種標(biāo)準(zhǔn)的錯(cuò)配情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.827，P=0.002)，其中0Ag MM標(biāo)準(zhǔn)配型的3～4 MM比例高于Res M標(biāo)準(zhǔn)，而0～2 MM比例低于Res M標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生情況 225例腎移植患者中，術(shù)后出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)68例，其中66例經(jīng)免疫抑制治療后恢復(fù)正常，2例無法恢復(fù)行移植腎切除。0Ag MM標(biāo)準(zhǔn)與Res M標(biāo)準(zhǔn)的0～2 MM組、3～4 MM組術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。在0Ag MM配型標(biāo)準(zhǔn)下，5～6 MM組、3～4 MM組、0～2 MM組術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生率依次降低(均P<0.05)。在Res M配型標(biāo)準(zhǔn)下，3～4 MM組術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生率高于0～2 MM組(P<0.05)。見表3。

表3 兩種配型標(biāo)準(zhǔn)下患者術(shù)后急性排斥反應(yīng)[n(%)]

注：與0～2MM比較，*P<0.05；與3～4MM比較，#P<0.05。

2.3 移植腎功能恢復(fù)情況 225例患者中，移植腎功能立即恢復(fù)156例(69.3%)，移植腎功能緩慢恢復(fù)25例(11.1%)，DGF 44例(19.6%)。0Ag MM標(biāo)準(zhǔn)與Res M標(biāo)準(zhǔn)的0～2 MM組、3～4 MM組移植腎DGF率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。在0Ag MM配型標(biāo)準(zhǔn)下，5～6 MM組、3～4 MM組、0～2 MM組DGF發(fā)生率依次降低(均P<0.05)；在Res M配型標(biāo)準(zhǔn)下，3～4 MM組DGF發(fā)生率高于0～2MM組(P<0.05)。見表4。

表4 兩種配型標(biāo)準(zhǔn)下DGF發(fā)生率比較[n(%)]

注：與0～2 MM比較，*P<0.05；與3～4 MM比較，#P<0.05。

3 討 論

HLA系統(tǒng)是人類主要組織相容性系統(tǒng)，是導(dǎo)致移植物排斥反應(yīng)的主要抗原。由于HLA抗原的多態(tài)性，要為腎移植受者找到HLA完全相同的腎臟非常困難。美國(guó)國(guó)立器官分配中心制定了HLA 0Ag MM標(biāo)準(zhǔn)，與傳統(tǒng)的抗原配型標(biāo)準(zhǔn)相比，該標(biāo)準(zhǔn)可以提高供-受者HLA的匹配率，減少移植物丟失。譚建明等[7]建立了目前國(guó)內(nèi)比較認(rèn)同的中國(guó)漢族人群HLA-Ⅰ、Ⅱ類Res M標(biāo)準(zhǔn)，提高了供-受者組織相容的匹配率，降低了移植排斥發(fā)生率。在本組225例壯族腎移植患者中，按0Ag MM標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)3～4 MM者的比例較高，為73.3%，高于按Res M標(biāo)準(zhǔn)下的比例，而達(dá)0～2 MM者的比例低于按Res M標(biāo)準(zhǔn)下的比例，這提示Res M標(biāo)準(zhǔn)能提高腎移植供-受者HLA相配的概率。

在腎移植中，供受者的組織相容程度與腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生情況密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，0Ag MM標(biāo)準(zhǔn)與Res M標(biāo)準(zhǔn)的0～2 MM組、3～4 MM組術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；而在同一標(biāo)準(zhǔn)下，0～2 MM組的急性排斥反應(yīng)發(fā)生率均低于3～4 MM組(均P<0.05)。提示按照Res M標(biāo)準(zhǔn)配型并不增加急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率；同一標(biāo)準(zhǔn)下酸殘基錯(cuò)配個(gè)數(shù)越少，急性排斥反應(yīng)發(fā)生率越低。

李留洋等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HLA抗體影響移植腎早期腎功能恢復(fù)，隨著錯(cuò)配率的增加，術(shù)后抗供者的特異性抗體出現(xiàn)升高的比率也逐漸增加。本研究結(jié)果顯示，0Ag MM標(biāo)準(zhǔn)與Res M標(biāo)準(zhǔn)的0～2 MM組、3～4 MM組的DGF發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，提示按照Res M標(biāo)準(zhǔn)配型并不增加DGF的發(fā)生率。而在同一標(biāo)準(zhǔn)下，0Ag MM配型結(jié)果為0～2 MM組的DGF率低于3～4 MM組(P<0.05)，提示錯(cuò)配個(gè)數(shù)越多，DGF發(fā)生率越高。

綜上所述，與0Ag MM標(biāo)準(zhǔn)比較，按照Res M標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配型能提高腎移植供-受者HLA相配的概率，但不增加移植腎急性排斥發(fā)生率及DGF率，這種配型策略亦適用于壯族人群腎移植。