孫凱，李冬秀，楊靖，董驥馳，嚴(yán)賢誠，羅立新，劉永柱，肖武名，王慧，陳志強(qiáng)，郭濤

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水稻耐淹成苗率相關(guān)性狀全基因組的關(guān)聯(lián)分析

孫凱，李冬秀，楊靖，董驥馳，嚴(yán)賢誠，羅立新，劉永柱，肖武名，王慧，陳志強(qiáng)，郭濤

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣州 510642）

【背景】耐淹成苗率低是限制直播稻產(chǎn)量的重要因素，挖掘高種子活力、低氧萌發(fā)能力強(qiáng)的水稻材料是提高耐淹成苗率的關(guān)鍵，但控制耐淹成苗率的遺傳位點(diǎn)的挖掘仍然比較有限。【目的】利用來源廣泛的自然種質(zhì)，分析影響耐淹成苗率的關(guān)鍵表型性狀，挖掘相關(guān)的遺傳位點(diǎn)和候選基因，為直播稻耐淹成苗機(jī)理研究提供一定的理論和材料基礎(chǔ)。【方法】以200份來源廣泛的水稻種質(zhì)為材料，在有氧環(huán)境下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，測量種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)；在低氧條件下測量芽鞘長和芽鞘直徑；進(jìn)行耐淹成苗試驗(yàn)，水深10 cm，20 d后測量耐淹成苗率。分析各性狀間的相關(guān)性，挖掘影響耐淹成苗率的關(guān)鍵性狀；利用簡化基因組測序?qū)σ陨?個表型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定與性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，并在關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)篩選候選基因；對02428和YZX 2份材料進(jìn)行有氧、無氧以及氧氣含量轉(zhuǎn)換條件下的轉(zhuǎn)錄組檢測，結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，分析候選基因的表達(dá)模式差異。【結(jié)果】種子活力、芽鞘表型和耐淹成苗率在200份材料間存在廣泛的遺傳變異，其中，芽鞘長和活力指數(shù)的變異系數(shù)最大；相關(guān)分析結(jié)果表明，芽鞘長、活力指數(shù)與耐淹成苗率呈極顯著正相關(guān)；通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，共鑒定出8個與活力指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，15個與芽鞘長顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)；結(jié)合基因組注釋，在關(guān)聯(lián)區(qū)間篩選出6個與活力指數(shù)相關(guān)的候選基因，7個與芽鞘長度相關(guān)的候選基因；進(jìn)一步比較13個基因在有氧、無氧及氧氣轉(zhuǎn)換條件下的表達(dá)模式以及表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)、、表達(dá)量變化顯著，表現(xiàn)出對氧氣處理的敏感性。【結(jié)論】種子活力、芽鞘長與耐淹成苗率密切相關(guān)，可作為篩選高耐淹成苗水稻材料的重要性狀。全基因組關(guān)聯(lián)分析、轉(zhuǎn)錄組分析與基因表達(dá)模式比較的聯(lián)合應(yīng)用可提高候選基因的篩選效率。水稻耐淹成苗過程可能受到與逆境脅迫、光合作用相關(guān)基因的調(diào)控。

水稻；種子活力；耐低氧萌發(fā)；全基因組關(guān)聯(lián)分析；轉(zhuǎn)錄組分析

0 引言

【研究意義】水稻是世界上最重要的糧食作物，全世界近1/2的人口以稻米為主食。水稻也是中國最主要的糧食作物，中國2/3的人口以稻米為主糧，水稻播種面積占國內(nèi)糧食種植面積的27%左右[1]。在水稻各種生產(chǎn)方式中，直播技術(shù)由于具有輕型、高效、節(jié)水、省工的優(yōu)點(diǎn)，正逐漸成為水稻輕簡高效栽培的理想方式。直播技術(shù)分水直播、濕直播和旱直播3種形式，其中，濕直播與旱直播成苗率較高，但田間操作難度大，且容易受到草害、鳥害和蟲害影響，而水直播是直接將種子撒播于淺水層覆蓋的土壤中，田間操作難度低，雜草危害輕，易于為農(nóng)民接受，在中國水稻直播生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。然而，水直播的種子萌發(fā)時處于淹水條件下，受到低氧脅迫，對品種的耐淹成苗能力具有較高要求，不適合直播的品種通常耐淹成苗能力差，田間秧苗群體不均勻，進(jìn)而影響直播產(chǎn)量。水稻的胚芽鞘是極少數(shù)可以在缺氧條件下生長的植物組織之一[2]。缺氧環(huán)境促進(jìn)水稻胚芽鞘的伸長，抑制幼莖和幼根的生長。水稻胚芽鞘通過快速伸長到達(dá)有氧環(huán)境，為胚芽和胚根的生長提供氧氣。在氧氣供應(yīng)下，水稻種子胚芽和胚根的生長很大程度上受到種子活力的影響，種子活力越高，幼苗生長越快，抗逆性越強(qiáng)，田間群體表現(xiàn)越整齊。因此，水稻耐淹成苗能力受到胚芽鞘性狀和種子活力性狀的共同控制。在解析水稻耐淹成苗能力與胚芽鞘性狀、種子活力性狀關(guān)系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)掘與耐淹成苗性狀有關(guān)的遺傳位點(diǎn)并獲取分子標(biāo)記，對于培育適合直播的水稻品種具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻耐淹萌發(fā)的遺傳機(jī)制比較復(fù)雜，已有的研究表明不同水稻品種的耐淹萌發(fā)能力存在顯著差異，耐缺氧的品種比不耐缺氧的品種有著更長的芽鞘[3-4]，表明這一性狀受到了遺傳位點(diǎn)的控制。陳孫祿等[5]通過對粳稻80380與秈稻RP2334的高代回交自交系連鎖分析，發(fā)現(xiàn)了4個控制耐淹萌發(fā)的QTL。Septiningsih等[6]以淹水發(fā)芽21 d的存活率為指標(biāo)檢測到6個QTL，其中位于第7染色體的位點(diǎn)得到了另一個群體的驗(yàn)證，說明其控制耐淹萌發(fā)的真實(shí)性。芽鞘的生長與中胚軸的發(fā)育密切相關(guān)，Lee等[7]采取5 cm的深播脅迫，用Kasalath/Nip構(gòu)建98個回交重組自交系對水稻幼苗中胚軸長度進(jìn)行QTL定位，發(fā)現(xiàn)在第1、3、6染色體有3個關(guān)于中胚軸伸長的QTL，依次為、和，其中和的貢獻(xiàn)率分別為12.89%和8.28%，的貢獻(xiàn)率在2個獨(dú)立重復(fù)中分別為37.56%和26.97%。已有的報道大部分基于雙親分離群體（如RIL、NIL、BIL等）進(jìn)行遺傳位點(diǎn)挖掘，受限于雙親遺傳差異或分子標(biāo)記密度，所能鑒定的耐淹萌發(fā)位點(diǎn)比較有限。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）以自然群體長期重組交換保留下來的位點(diǎn)間連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）為基礎(chǔ)，通過檢測表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)的有效關(guān)聯(lián)來尋找遺傳位點(diǎn)[8-9]，對于復(fù)雜數(shù)量性狀位點(diǎn)的挖掘具有突出優(yōu)勢。目前，在水稻中展開了大量的GWAS研究，對水稻的代謝性狀、葉綠素含量、抽穗期、穗型、種子發(fā)芽率、芒長、耐冷、柱頭外露等很多性狀展開了GWAS分析，解釋了各個性狀的表型變異和遺傳基礎(chǔ)[10-14]。同樣，水稻種子耐低氧、耐淹相關(guān)性狀也運(yùn)用GWAS技術(shù)進(jìn)行了研究，王洋等[15]用91對SSR標(biāo)記在94個太湖流域核心種質(zhì)組成的自然群體中采用關(guān)聯(lián)分析的方法挖掘遺傳控制位點(diǎn)，共找到6個SSR標(biāo)記與耐淹萌發(fā)關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。HSU等[16]利用高密度SNP標(biāo)記對153份水稻品種進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，共找到88個與低氧萌發(fā)顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn)，其中部分位點(diǎn)與前人報道相符。Lee等[17]報道了一個控制水稻淹水萌發(fā)的基因，該基因的存在能夠使水稻種子在淹水時快速生長出胚芽鞘以應(yīng)對淹水脅迫，而該基因的功能缺失突變體淹水萌發(fā)時不能長出胚芽鞘。隨著基因組測序技術(shù)的不斷完善，利用測序獲得極高密度SNP將顯著提升GWAS策略在遺傳位點(diǎn)鑒定方面的效率。【本研究切入點(diǎn)】耐淹成苗率是影響直播稻產(chǎn)量的重要性狀。耐淹成苗率的高低與種子活力以及耐低氧萌發(fā)密切相關(guān)?，F(xiàn)有關(guān)于水稻耐淹成苗的研究多是以芽鞘性狀作為指標(biāo)，而耐淹成苗率與種子活力的關(guān)系報道較少。此外，前人進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析定位的與耐淹成苗相關(guān)的位點(diǎn)較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對影響耐淹成苗率的關(guān)鍵表型性狀進(jìn)行分析，挖掘相關(guān)的遺傳位點(diǎn)和候選基因，為直播稻品種選育和耐淹成苗機(jī)理研究提供一定的理論和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料包括200份種質(zhì)資源，來自于中國（主要來自廣東）、菲律賓國際水稻研究所（IRRI）、越南、印度、尼泊爾、韓國等國家和地區(qū)，材料具體名稱見電子版附表1。

1.2 正常條件下種子萌發(fā)試驗(yàn)

200份種質(zhì)材料，每個材料設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)取200粒種子（經(jīng)過挑選，去除空粒、癟粒及發(fā)霉的種子），共取600粒種子，放置在30℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。測量發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)。

發(fā)芽率=（發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)）×100%

發(fā)芽指數(shù)=∑（Gt/Dt），Gt指第t天新萌發(fā)的正常幼苗數(shù)，Dt指發(fā)芽的天數(shù)。

活力指數(shù)=∑（Gt/Dt）×幼苗的干重

1.3 低氧條件下種子萌發(fā)試驗(yàn)

200份種質(zhì)材料，每個材料設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)取20粒種子（經(jīng)過挑選，去除空粒、癟粒及發(fā)霉的種子），共取60粒種子，放置在灌滿水的50 mL透明塑料管中，以此來模擬淹水的低氧環(huán)境，放置在30℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。6 d后將種子掃描成圖像，利用根系掃描儀（Epson LA2000）測量芽鞘長度、芽鞘直徑。

1.4 耐淹成苗試驗(yàn)

200份種質(zhì)材料，每個材料設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)取30粒種子（經(jīng)過挑選，去除空粒、癟粒及發(fā)霉的種子），共取90粒種子。在12 cm直徑塑料花盆加3 cm厚的砂土，放置種子，種子上覆0.5 cm的砂土，加水至水深10 cm，自然條件下培養(yǎng)20 d，20 d后測量成苗率。以種子的葉伸出水面并具備正常的根為存活個體，調(diào)查存活種子占全部種子的比例為成苗率。

成苗率=（成苗數(shù)/種子總數(shù)）×100%

1.5 簡化基因組測序與全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用CTAB法進(jìn)行DNA提取，檢測合格后利用Illumina HiSeq測序平臺，進(jìn)行雙末端（Paired-End）150測序。采用SAMTOOLS等軟件進(jìn)行群體SNP的檢測。利用貝葉斯模型檢測群體中的多態(tài)性位點(diǎn)，經(jīng)過條件為dp2、Miss0.9、Maf0.01的過濾后，將得到的高質(zhì)量SNP，利用ANNOVAR軟件進(jìn)行群體SNP注釋。運(yùn)用TreeBest軟件計算距離矩陣，以此為基礎(chǔ)，通過鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。通過GCTA軟件計算特征向量以及特征值，并利用R軟件繪制PCA分布圖。使用GEMMA對性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，通過關(guān)聯(lián)的顯著度（-value），篩選出候選SNPs。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測序試驗(yàn)處理

選用秈稻品種玉針香與粳稻品種02428，分別在30℃有氧條件下培養(yǎng)3 d，第4天轉(zhuǎn)入裝滿水的離心管中進(jìn)行低氧處理1 d；同時在30℃的裝滿水的離心管中，低氧條件下培養(yǎng)3 d，第4天轉(zhuǎn)入有氧條件培養(yǎng)1 d。每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)每天取樣1 g，錫箔紙包裹置于液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆?。對樣品中的轉(zhuǎn)錄組RNA進(jìn)行高通量測序，將得到的測序片段（reads）比對到參考序列上，計算參考序列的每個基因上reads的覆蓋深度，并進(jìn)行歸一化，所得的結(jié)果用以表示基因的表達(dá)量。利用基于R語言的軟件包edgeR，處理RNA-seq數(shù)據(jù)成對樣本組間差異顯著性。利用FDR與log2FC來篩選差異基因，篩選條件為FDR＜0.05且|log2FC|＞1。委托廣州基迪奧生物科技有限公司構(gòu)建RNA測序文庫并完成高通量測序。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入和整理，使用SPSS19.1對所有表型數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計算表型的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差等，并進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析等。

2 結(jié)果

2.1 200份材料的性狀表現(xiàn)

200份材料在種子活力和低氧萌發(fā)性狀方面具有豐富變異（表1）。其中，活力指數(shù)和耐淹成苗率的變異系數(shù)均超過了30%，而發(fā)芽率的變異系數(shù)最小，僅為5.1564%。與種子活力相關(guān)的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)變異系數(shù)具有較大差別，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)變異系數(shù)顯著高于發(fā)芽率，表明發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)可以更好地體現(xiàn)材料間的差異。胚芽鞘長變異系數(shù)顯著高于胚芽鞘直徑，表明不同品種的胚芽鞘長度差別明顯，而胚芽鞘直徑的差別較小。耐淹成苗率在不同品種間也具有較大差異，說明研究材料在此性狀上具有廣泛的遺傳分離。由性狀頻率分布圖（圖1）可見，上述性狀均呈連續(xù)分布，表明是由微效多基因控制的數(shù)量性狀。

2.2 各性狀間的相關(guān)性分析

相關(guān)分析表明，耐淹成苗率與發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚芽鞘長度呈極顯著正相關(guān)，其中，胚芽鞘長與耐淹成苗率的相關(guān)性最高，達(dá)0.271（表2）。此外，不同性狀間表現(xiàn)出復(fù)雜的相關(guān)性，發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)呈極顯著正相關(guān)，與胚芽鞘長顯著正相關(guān)，與胚芽鞘直徑呈極顯著負(fù)相關(guān)；發(fā)芽指數(shù)與發(fā)芽率、活力指數(shù)、胚芽鞘長均呈極顯著正相關(guān)，與胚芽鞘直徑呈極顯著負(fù)相關(guān)；活力指數(shù)與發(fā)芽指數(shù)、胚芽鞘長呈極顯著正相關(guān)；胚芽鞘長與發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)呈極顯著正相關(guān)，與發(fā)芽率、胚芽鞘直徑顯著正相關(guān)；胚芽鞘直徑與胚芽鞘長顯著正相關(guān)，與發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果表明，胚芽鞘長和活力指數(shù)是影響耐淹成苗率的關(guān)鍵性狀。

表1 表型性狀

表2 表型相關(guān)性分析

*＜0.05條件下差異顯著；**＜0.01條件下差異極顯著

*represent significant variation at＜0.05; **represent highly significant variation at＜0.01

a：發(fā)芽率；b：發(fā)芽指數(shù)；c：活力指數(shù)；d：胚芽鞘長；e：胚芽鞘直徑；f：耐淹成苗率

2.3 胚芽鞘長和活力指數(shù)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)位點(diǎn)檢測

2.3.1 SNP獲取 利用200份種質(zhì)進(jìn)行簡化基因組測序，基因組的平均測序深度為14.16X，平均覆蓋度為11.24%。利用SAMTOOLS軟件檢測共獲得了652 457個SNP位點(diǎn)，經(jīng)過條件為dp2、Miss0.9、Maf0.01的過濾后，最后共獲得了161 657個高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)用于后續(xù)分析。

2.3.2 群體結(jié)構(gòu)分析 利用SNP數(shù)據(jù)對200份種質(zhì)的群體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，可見此關(guān)聯(lián)群體主要可分為2個亞群，第一個亞群包括6個材料；另外一個亞群包括其他194份材料（圖2-a）。通過GCTA軟件計算特征向量以及特征值，并利用R軟件繪制PCA分布圖（圖2-b），PCA分析結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果一致。

2.3.3 活力指數(shù)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)鑒定 對200份材料的活力指數(shù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（圖3）。左側(cè)為曼哈頓圖，圖中水平的虛線表示顯著性水平，當(dāng)-lg10（）值高于虛線時，認(rèn)為該SNP與該性狀顯著關(guān)聯(lián)；右側(cè)為Q-Q圖（Quantile-quantile plot），表示實(shí)際值和無關(guān)聯(lián)零假設(shè)期望值的分布。Manhattan圖與Q-Q圖均表明在全基因組范圍內(nèi)存在與活力指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。以-lg10()=6為閾值，共檢測到了8個與活力指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)（表3），分布在第1、2、5、6、10、11和12染色體上。依據(jù)LD衰減距離，對關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)上下游各100 kb區(qū)域進(jìn)行了基因篩選，共篩選得到154個基因。依據(jù)基因組注釋，篩選出6個與物質(zhì)代謝、逆境脅迫相關(guān)的基因（表4）。

圖3 活力指數(shù)曼哈頓圖及Q-Q圖

2.3.4 胚芽鞘長關(guān)聯(lián)位點(diǎn)鑒定 圖4為胚芽鞘長關(guān)聯(lián)分析的曼哈頓圖和Q-Q圖（quantile-quantile plot）。以-lg10()=4為閾值，共檢測到了15個與胚芽鞘長度顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，分布在第3、4、5、6、8和11染色體上（表5）?；谒净蚪M注釋，依據(jù)LD衰退水平，本研究在關(guān)聯(lián) SNP位點(diǎn)上下游區(qū)域100 kb，共檢測到296個基因。依據(jù)基因組注釋，篩選出6個與種子生長發(fā)育以及逆境脅迫相關(guān)的基因（表6）。

表3 活力指數(shù)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)

表4 活力指數(shù)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)候選基因

圖4 胚芽鞘長曼哈頓圖和Q-Q圖

2.3.5 候選基因表達(dá)模式分析 基于粳稻02428與秈稻玉針香轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，獲得上述13個基因在有氧、無氧及氧氣轉(zhuǎn)換下的基因表達(dá)熱圖（圖5）。有3個基因表現(xiàn)出對氧氣處理的敏感性，分別為、和進(jìn)一步對這三個基因的表達(dá)進(jìn)行分析（圖6），可知與在02428和玉針香中表達(dá)模式相近，主要體現(xiàn)在：（1）有氧條件下的表達(dá)高于無氧；（2）從有氧轉(zhuǎn)換到低氧條件，其表達(dá)顯著降低；（3）從無氧轉(zhuǎn)換到有氧，其表達(dá)上升。與活力指數(shù)性狀關(guān)聯(lián)，編碼AP2結(jié)構(gòu)域蛋白的基因；與胚芽鞘長性狀關(guān)聯(lián)，編碼含BURP結(jié)構(gòu)域蛋白的基因。編碼葉綠素a-b結(jié)合蛋白基因，與胚芽鞘長性狀關(guān)聯(lián)，該基因在2個材料中的表達(dá)模式有較大不同。在02428中，該基因在低氧轉(zhuǎn)換到有氧時表達(dá)量顯著上調(diào)，并且在有氧轉(zhuǎn)換到低氧時表達(dá)量也有上調(diào)；在玉針香中，該基因同樣在低氧轉(zhuǎn)換到有氧時表達(dá)量明顯上調(diào)，但是在有氧轉(zhuǎn)換到低氧時表達(dá)量并無明顯差異。

表5 胚芽鞘長關(guān)聯(lián)位點(diǎn)

表6 胚芽鞘長關(guān)聯(lián)位點(diǎn)候選基因

圖6 候選基因表達(dá)模式

3 討論

3.1 活力指數(shù)和胚芽鞘性狀是影響直播稻全苗率的關(guān)鍵性狀

全苗率低一直是直播稻產(chǎn)量不高不穩(wěn)的首要問題，它直接影響群體的起點(diǎn)苗數(shù)，進(jìn)而影響群體質(zhì)量。一般認(rèn)為三葉期成苗數(shù)達(dá)到落田稻粒數(shù)70%以上，基本上達(dá)到全苗目標(biāo)，但生產(chǎn)上往往達(dá)不到50%[30]。有學(xué)者提出通過選用耐逆境發(fā)芽出苗較好的水稻品種可有效解決直播稻全苗問題。因此，種子活力和耐缺氧能力是直播稻品種選育的重要指標(biāo)。

直播稻在淹水萌發(fā)期間可以分為2個時期，第一個時期為胚芽鞘的快速生長，此時通過芽鞘的快速伸長突破水面以獲取氧氣，根和第一片葉的生長受到抑制[31-32]；第二個時期為胚芽和胚根的形態(tài)建成，此時胚芽鞘停止生長，胚芽和胚根在胚芽鞘輸送氧氣的支持下快速發(fā)育，完成幼苗形態(tài)構(gòu)成，種子活力在此過程起重要作用[33]。本研究結(jié)果表明，活力指數(shù)與芽鞘長的變異系數(shù)遠(yuǎn)大于其他表型，因此活力指數(shù)和芽鞘長可以更好地反映遺傳差異。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)耐淹成苗率與活力指數(shù)以及胚芽鞘長度呈極顯著正相關(guān)，與前人研究相符[33-34]。因此，高活力指數(shù)與發(fā)達(dá)的胚芽鞘是選育優(yōu)良直播稻品種必須考慮的重要性狀，對控制這些性狀的遺傳位點(diǎn)挖掘具有重要意義。

3.2 GWAS是鑒定活力指數(shù)與芽鞘長性狀遺傳位點(diǎn)的有效方法

本研究利用基于重測序的高密度SNP標(biāo)記，對活力指數(shù)和胚芽鞘性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。與基于RIL、BIL、DH群體的QTL定位方法比較，全基因組關(guān)聯(lián)省去構(gòu)建家系的時間，所能鑒定的遺傳位點(diǎn)更加精細(xì)，更適用于耐低氧萌發(fā)復(fù)雜性狀的分析。本研究共檢測到8個與活力指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，其中有4個位點(diǎn)與前人報道區(qū)間位于同一位置，第2染色體26540479位置與Bi等[18]報道的基因座位相同，同時也與Sugiyama等[19]報道的基因座位相同；第6染色體5542656位置與Moeder等[20]報道的基因座位相同；第10染色體13589547位置與Mori等[21]報道的基因座位相同，同時也與Miyoshi等[22]報道的基因座位相同；第12染色體23449435位置與Miyoshi等[22]報道的基因座位相同，同時也與Zeng等[23]報道的基因座位相同，這4個位點(diǎn)在前人研究中分別控制了水稻細(xì)胞的增殖發(fā)育、細(xì)胞程序性死亡以及水稻花粉管發(fā)育等性狀。本研究同時檢測到15個與胚芽鞘長度顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，有4個位點(diǎn)與前人報道區(qū)間位于同一位置，第5染色體15450007位置與Liang等[24]報道的基因座位相同；第6染色體21932341位置與Singh等[25]報道的基因座位相同，同時也與Zhu等[26]報道的基因座位相同；第6染色體29822164位置與Yong等[27]報道的基因座位相同，同時也與Zhong等[28]報道的基因座位相同；第8染色體5689664位置與Cheung等[29]報道的基因座位相同，這4個位點(diǎn)分別控制了水稻能量運(yùn)轉(zhuǎn)、抗病以及干旱脅迫、高溫脅迫等性狀。這些共定位的位點(diǎn)一方面驗(yàn)證了本研究結(jié)果的可靠性，另一方面也提供了更多遺傳信息，前人并未對共定位位點(diǎn)與水稻種子活力和耐淹能力的性狀進(jìn)行描述，暗示這些位點(diǎn)可能具有多效性。此外，本研究也獲得19個前人未報道的控制種子活力或耐低氧萌發(fā)位點(diǎn)，為候選基因的篩選提供了基礎(chǔ)。

3.3 水稻耐低氧萌發(fā)過程可能受到逆境脅迫、光合作用相關(guān)基因的調(diào)控

根據(jù)02428和YZX 2個材料的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，本研究對篩選出的13個關(guān)聯(lián)位點(diǎn)區(qū)間候選基因在有氧條件、低氧條件及氧氣條件轉(zhuǎn)換下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)有3個基因表現(xiàn)出對氧氣處理的敏感性，分別為、和。其中，位于種子活力指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)區(qū)間，該基因編碼含AP2結(jié)構(gòu)域蛋白的基因。在高等植物中，具有AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子在植物的開花發(fā)育以及抗逆過程中起重要作用[35]，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果可知，該基因在低氧條件下的表達(dá)量較低，而在有氧條件下表達(dá)量較高，因此，該基因的高表達(dá)對種子活力增強(qiáng)具有促進(jìn)作用。位于胚芽鞘長顯著關(guān)聯(lián)區(qū)間，為編碼葉綠素a-b結(jié)合蛋白基因，此類蛋白復(fù)合體能捕獲光能，并迅速把光能傳到PSⅠ和光系統(tǒng)Ⅱ的反應(yīng)中心，引起光化學(xué)反應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能[36]，是植物進(jìn)行光合作用的重要組成部分。該基因在兩個材料中的表達(dá)模式有較大不同，在02428中，該基因在低氧轉(zhuǎn)換到有氧時表達(dá)量顯著上調(diào)，并且在有氧轉(zhuǎn)換到低氧時表達(dá)量也有上調(diào)；在玉針香中，該基因同樣在低氧轉(zhuǎn)換到有氧時表達(dá)量明顯上調(diào)，但是在有氧轉(zhuǎn)換到低氧時表達(dá)量并無明顯差異。在低氧轉(zhuǎn)換到有氧的處理中，因種子在淹水萌發(fā)前期只進(jìn)行芽鞘的快速生長，芽鞘并不含葉綠素，幾乎不進(jìn)行光合作用，轉(zhuǎn)換到有氧條件后，莖稈以及葉片開始生長，葉綠素大量合成，光合作用增強(qiáng)，因此表達(dá)量大幅上升；而在有氧轉(zhuǎn)換到低氧的處理時，種子在有氧條件下正常萌發(fā)生長，光合作用隨著種子萌發(fā)即開始進(jìn)行，轉(zhuǎn)換到低氧后由于葉片已經(jīng)長出，光合作用仍在進(jìn)行，因此，表達(dá)量變化并不明顯，推測該基因?qū)λ痉N子耐淹生長具有正調(diào)控作用。此外，由于低氧條件下02428的胚芽鞘生長快于玉針香，因此，該基因還可能是低氧條件下02428和玉針香胚芽鞘生長差異的影響因子。位于胚芽鞘長顯著關(guān)聯(lián)區(qū)間，該基因編碼含BURP結(jié)構(gòu)域蛋白的基因，此類蛋白不僅與植物的生殖發(fā)育相關(guān)，而且在植物耐受非生物脅迫的過程中具有重要的作用[37]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果可知，該基因的表達(dá)模式與相近，在低氧條件下的表達(dá)量較低，而在有氧條件下表達(dá)量較高，推測該基因的高表達(dá)抑制了胚芽鞘的生長，對種子耐低氧脅迫起負(fù)調(diào)控作用。

4 結(jié)論

水稻耐淹成苗率與芽鞘長、活力指數(shù)呈極顯著正相關(guān)，以種子活力、芽鞘長度為指示性狀可以篩選出耐淹成苗能力較強(qiáng)的材料。全基因組關(guān)聯(lián)分析、轉(zhuǎn)錄組分析與基因表達(dá)模式比較的聯(lián)合應(yīng)用可提高相關(guān)性狀候選基因的篩選效率。水稻耐淹萌發(fā)過程可能受到與逆境脅迫、光合作用相關(guān)基因的調(diào)控。

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Genome-wide association analysis for rice submergence seedling rate

Sun Kai, Li Dongxiu, Yang Jing, Dong Jichi, Yan Xiancheng, Luo Lixin, Liu Yongzhu, XIAO WuMing, Wang Hui, Chen Zhiqiang, Guo Tao

(National Plant Space Breeding Engineering Technology Research Center, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

【Background】The low seedling rate of direct seeding rice is an important factor limiting its yield. Mining rice materials with high seed viability and low oxygen germination ability is the key to improving the seedling rate and solving the problem of seedlings in direct seeding rice. 【Objective】The key phenotypic traits affecting the rate of emergence and tolerance of seedlings were analyzed, and the relevant genetic loci and candidate genes were mined to provide a theoretical and material basis for the study of direct seeding rice cultivars and the mechanism of resistance to flooding. 【Method】Using 200 rice germplasms from a wide range of sources. The germination test was carried out in an aerobic environment, and the seed viability phenotype was measured including germination rate, germination index and viability index; The coleoptile length and coleoptile diameter were measured under hypoxic conditions. The flood-tolerant seedling experiment was carried out, the water depth was 10cm, and the flood-tolerant seedling rate was measured after 20d. The correlation between various traits was analyzed, and the key traits affecting the rate of tolerance to flooding were explored. Genome-wide association analysis was performed on the above six phenotypes by simplified genome sequencing, and SNP sites significantly associated with traits were identified and within the correlation interval. Screening candidate genes related to the research purpose; transcriptome detection under the conditions of aerobic, anaerobic and oxygen content conversion of 02428 and YZX two materials, combined with genome-wide association analysis results, analysis of differences in expression patterns of candidate genes. 【Result】Seed viability, coleoptile phenotype and seedling rate showed extensive genetic variation among 200 materials. Among them, the variation of coleoptile length and viability index was the most abundant, and the coefficient of variation was the largest. At the same time, the results of correlation analysis showed that there was a significant positive correlation between the coleoptile length, viability index and the seedling rate. Through genome-wide association analysis, 8 sites significantly associated with the viability index and 15 sites significantly associated with the coleoptile length were identified. Based on the correlation of seed growth and development and stress resistance, six candidate genes related to viability index and seven candidate genes related to the coleoptile length were screened in the relevant interval. Further comparison of 13 genes in aerobic and anaerobic the expression patterns and expression changes under oxygen conversion conditions showed that the three genes,andshowed different expression patterns when the oxygen content changed, and the expression amount changed significantly, showing sensitivity to oxygen treatment. 【Conclusion】Seed viability and coleoptile length were closely related to the rate of flooding and seedling emergence, which could be used as an important trait for screening flood-tolerant rice materials. Combining genome-wide association analysis, transcriptome analysis and gene expression pattern can improve the screening efficiency of candidate genes for hypoxia tolerance germination of rice seeds; flooding tolerance of rice seedlings may be regulated by genes related to stress and photosynthesis..

rice; seed vitality; hypoxia-resistant germination; genome-wide association analysis; transcriptome analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.03.001

2018-09-18；

2018-11-12

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2017YFD0100104，2016YFD0102102）、廣東省科技計劃（2015B02031011）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CAＲS-01-12）

孫凱，E-mail：m15018435726_2@163.com。通信作者郭濤，E-mail：guo.tao@vip.163.com。信作者陳志強(qiáng)，E-mail：zqchen@scau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）