(湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心,三峽大學(xué)食品生物技術(shù)研究中心,生物與制藥學(xué)院,湖北宜昌 443002)

作為天然色素的葉綠素具有抗氧化能力,可應(yīng)用于醫(yī)療、食品、化妝品等行業(yè)[1-2],近年來對(duì)植物葉片和蔬菜中葉綠素的抗氧化性研究日益增多,但對(duì)水果中的葉綠素抗氧化性研究仍然較少。研究發(fā)現(xiàn),葉綠素及其衍生物都具有一定的抗氧化能力,且獼猴桃果肉中的已知的葉綠素主要有葉綠素a、葉綠素b、脫鎂葉綠素a、脫鎂葉綠素b、植基葉綠素a、植基葉綠素b、脫鎂葉綠酸鹽a[3],但其中葉綠素的種類和含量因原料的不同差異也較大[4],因此本實(shí)驗(yàn)在鑒定獼猴桃中葉綠素及其衍生物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,進(jìn)行抗氧化性研究。其中葉綠素母系結(jié)構(gòu)以葉綠素a和葉綠素b為例,分子量分別為893和907,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示[5]。

圖1 葉綠素a,b的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of chlorophyll a and b

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基,在有機(jī)溶劑中呈紫色,在517 nm波長(zhǎng)下有較大吸收,當(dāng)加入抗氧化劑后一部分自由基被清除,使在該波長(zhǎng)下吸收降低,以此來評(píng)估物質(zhì)的抗氧化活性[6];Fe3+在測(cè)定化合物提供電子的情況下可被還原為Fe2+,吸光值越大還原能力越強(qiáng),即物質(zhì)的抗氧化性越好[7]。馬惠與程茵等[8-9]都采用DPPH法與鐵離子還原法進(jìn)行了抗氧化性研究;馬可純[10]在研究獼猴桃復(fù)合粉抗氧化研究中,以DPPH·清除能力和還原能力結(jié)果為指標(biāo),發(fā)現(xiàn)華優(yōu)鮮果的DPPH·清除能力和還原能力最高。

據(jù)近幾年研究表明,葉綠素及其衍生物具有一定的抗氧化活性,獼猴桃果實(shí)除高含量VC和多酚等抗氧化成分外,張麗華等[11]研究了提取液的抗氧化活性,但對(duì)其內(nèi)葉綠素及其衍生物的純品沒有研究。本研究以宜昌綠肉獼猴桃為原料,通過柱層析、質(zhì)譜和核磁等技術(shù),對(duì)果肉中葉綠素進(jìn)行組分分析與結(jié)構(gòu)鑒定,得到葉綠素單品和其降解產(chǎn)物,為研究獼猴桃在加工過程中的變色機(jī)理提供理論支撐,通過DPPH法和Fe3+還原力法對(duì)其單品進(jìn)行了抗氧化活性研究,為今后研究其穩(wěn)定性、藥理性質(zhì)等奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮綠肉獼猴桃 從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買;甲醇、石油醚、三氯化鐵、DPPH(2,2-二苯基-1-1苦肼基)二氯甲烷、無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮(均為分析純),甲醇、乙腈(均色譜純)、氘代甲醇和氘代氯仿 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;硅膠Gf254薄層色譜板 青島海洋化工廠;中性氧化鋁(100～200目)、D101大孔樹脂 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

EV312旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;UV-1800紫外可見分光光度計(jì) 島津制作所;6210 ESI/TOF質(zhì)譜儀 美國(guó)安捷倫;1200系列液相色譜儀 美國(guó)安捷倫;Bruker AVANCE III HD 400 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀 美國(guó)布魯克·道爾頓公司(Bruker Daltonics Inc.)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 獼猴桃葉綠素的制備 獼猴桃去皮打漿后,用丙酮∶甲醇體積比1∶1,液料比1.22 mL/g、提取時(shí)間236 min、提取溫度59 ℃提取,提取液于4000 r/min離心10 min,分離出上層提取液(黃綠色),剩余果渣用相同的提取方法再次提取,合并兩次提取液,減壓濃縮后標(biāo)記為脂溶性色素待測(cè),冰箱4 ℃下密閉避光保存。剩余果渣用蒸餾水與無水乙醇體積比1∶4,液料比1.22 mL/g、提取時(shí)間236 min、提取溫度59 ℃提取,提取液于4000 r/min離心10 min,分離上層提取液(黃褐色),減壓濃縮后標(biāo)記為水溶性色素待測(cè)[12],于冰箱4 ℃下密閉避光保存。

1.2.2 柱層析對(duì)獼猴桃色素的分離純化

1.2.2.1 填料預(yù)處理 中性氧化鋁:稱取250 g,加石油醚攪拌,浸泡10 min[13];D101大孔樹脂[14]:稱取100 g樹脂,95%乙醇浸泡24 h,充分溶脹后,用95%乙醇淋洗至流出液與水混合(1∶3)不呈白色渾濁,之后以蒸餾水洗凈乙醇。

1.2.2.2 洗脫條件 用D101樹脂柱分離純化水溶性色素,各濃度均用1000 mL乙醇進(jìn)行洗脫,濃度分別為20%、40%、95%,流速為1.5 mL/min,樹脂分離純化時(shí)上樣量為10 mL,分離得到的不同餾分用Gf254薄層色譜板點(diǎn)板,展開劑為丙酮∶二氯甲烷∶甲醇3∶6∶1;用氧化鋁柱分離純化脂溶性色素,用1000 mL石油醚:丙酮混合液進(jìn)行洗脫,比例分別為100%石油醚、10%、25%、50%、100%甲醇,柱層析分離純化時(shí)上樣量為15 mL,分離得到的不同餾分用Gf254薄層色譜板點(diǎn)板,展開劑為石油醚∶丙酮∶甲醇 8∶1∶1。

1.2.3 質(zhì)譜檢測(cè) 在JASCO J-815CD光譜儀上,采用0.1 cm和1 cm的石英試管,在室溫下,采用100 nm/min掃描速率、2 nm分辨率和32次掃描,用干燥氮?dú)鉀_洗,獲得ECD光譜。樣品在甲醇中以10-4mol/L或10-3mol/L的濃度溶解,并用溶劑減去光譜。

1.2.4 核磁檢測(cè) 樣品在Bruker AVANCE III HD 400 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀上進(jìn)行測(cè)試,溶劑為氘代甲醇和氘代氯仿,1H譜的工作頻率為400 MHz,脈沖序列為zg30,空掃次數(shù)(DS)為2次,采樣時(shí)間(AQ)為3.985 s,采樣次數(shù)(NS)為16次,增益值(RG)為101;13C譜的工作頻率為100 MHz,脈沖序列為zgpg30,空掃次數(shù)(DS)為4次,采樣時(shí)間(AQ)為1.363 s,采樣次數(shù)(NS)為1580次,增益值(RG)為161。

1.2.5 抗氧化活性研究

1.2.5.1 提取物對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定準(zhǔn)確稱取冷凍干燥后的各個(gè)待測(cè)樣品及VC樣品50 mg,分別用溶劑溶解并定容至25 mL,配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL溶液保存?zhèn)溆谩?/p>

將備用溶液用蒸餾水稀釋至所需的各個(gè)濃度,取3 mL各濃度樣品溶液加入3 mL 0.16 mmol/L DPPH乙醇溶液于25 ℃水浴加熱15 min后,在517 nm測(cè)溶液吸光度(A1),每個(gè)濃度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),取平均值,同時(shí)以3 mL樣品中加入3 mL蒸餾水測(cè)吸光度(A2),取3 mL蒸餾水代替樣品加入3 mL DPPH溶液測(cè)吸光度(A0)。以VC為對(duì)照,按下列公式計(jì)算DPPH·清除率,并計(jì)算自由基清除率IC50值[12-13]。

1.2.5.2 提取物對(duì)Fe3+還原力的測(cè)定 準(zhǔn)確樣品100 mg,溶劑溶解并定容至25 mL,配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL樣品溶液,稀釋成所需的不同質(zhì)量濃度,取2.5 mL各濃度的樣品溶液,加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀,50 ℃水浴20 min后急速冷卻,加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液混勻,0.2 μm水相濾膜過濾,取上清液5 mL,加入5 mL 0.02%三氯化鐵溶液混勻,10 min后在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。吸光度越大則還原能力越大,以VC作為陽性對(duì)照[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,取平均值,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microcal Origin 6作圖,IC50使用IC50計(jì)算器計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱層析分析

通過中性氧化鋁柱層析分離純化,得到4個(gè)脂溶性色素餾分,分別為組分A1100%石油醚餾分(黃綠色)、組分B1石油醚∶甲醇10∶1餾分(橄欖綠)、組分C1石油醚∶甲醇4∶1(藍(lán)綠色)、組分D1100% 甲醇餾分(黃綠色);通過D101樹脂柱分離純化,得到2個(gè)水溶性色素餾分,分別為組分E120%乙醇餾分(黃褐色)、組分F140%乙醇餾分(黃褐色)。其中組分C1根據(jù)文獻(xiàn)可知為葉綠素a[15]。

2.2 質(zhì)譜檢測(cè)分析

圖2是以組分A1、D1為例,ESI+-Q-TOF-MS測(cè)得[M+H]+的準(zhǔn)確質(zhì)量及其主要特征碎片離子m/z的圖譜。最終得到物質(zhì)A1的[M+H]+的準(zhǔn)確分子質(zhì)量為927.6967,與分子式C55H84O7N4相應(yīng);物質(zhì)B1的[M+H]+的準(zhǔn)確分子質(zhì)量為588.4304,與分子式C34H33O5N4相應(yīng);物質(zhì)D1的[M+H]+的準(zhǔn)確分子質(zhì)量為601.1116,與分子式C35H34O5N4相應(yīng);物質(zhì)E1的[M+H]+的準(zhǔn)確分子質(zhì)量為927.6985,與分子式C55H84O7N4相應(yīng);物質(zhì)F1的[M+H]+的準(zhǔn)確分子質(zhì)量為701.5039,與分子式C37H38O9N4相應(yīng)。

圖2 組分A1,D1的物質(zhì)母離子的準(zhǔn)確質(zhì)量和離子組成圖譜Fig.2 Accurate mass and ion composition atlas of material mother ions of components A1 and D1

2.3 核磁檢測(cè)分析

圖3是以A1、D1為例的1H和13C NMR譜。在13C NMR譜中,A1的δ 22.73、27.23、29.70、31.96、62.13、68.89、127.77、128.26、130.25;B1的δ 22.87、27.38、29.75、65.24、127.93、128.43、130.42、132.15、174.06;D1的δ22.85、29.49、37.93、126.84、127.38、129.75、179.07;E1的δ12.92、62.81、64.51、68.01、69.86、70.48、74.90、75.39、76.70、97.82;F1的δ61.37、61.47、64.50、68.00、70.48、74.90、76.70、97.82,與文獻(xiàn)[16-19]中香蕉的葉綠素及降解產(chǎn)物核磁數(shù)據(jù)高度吻合。

圖3 A1,D1的1H和13C NMR譜Fig.3 1H and 13C NMR spectra of A1 and D1

結(jié)合質(zhì)譜與核磁結(jié)果,鑒定五種物質(zhì)結(jié)構(gòu)式如下所示(圖4)。推測(cè)其中物質(zhì)A1是葉綠素b在酸性條件下,中心鎂離子丟失,被氫離子取代,且第Ⅱ吡咯環(huán)外的甲基氧化成羰基;物質(zhì)B1是脫鎂葉綠酸a副環(huán)上的羧基在酸性條件下與氫離子反應(yīng),生成羧酸;物質(zhì)D1推測(cè)的結(jié)構(gòu)與脫鎂葉綠酸a一致,證明該組分物質(zhì)為脫鎂葉綠酸a。物質(zhì)E1是葉綠素a的α位開環(huán),β和δ為加上兩個(gè)氧,與Vergeiner等[19]研究中的葉綠素?zé)晒馀c非熒光降解產(chǎn)物的共同前體(epi-pfcc)結(jié)構(gòu)類似,唯一區(qū)別在于物質(zhì)E1的葉綠醇并未斷裂,說明該物質(zhì)結(jié)構(gòu)是生成的降解產(chǎn)物共同前體反應(yīng)前一步的結(jié)構(gòu),與降解過程相符合;物質(zhì)F1是葉綠素a在用乙酸乙酯、甲醇和乙醇提取過程中,α位被氧化開環(huán),葉綠醇被乙酸取代,在酸性條件下鎂離子丟失,第I吡咯環(huán)外的烯基被加上了兩個(gè)氧,其結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)[16,20]中葉綠素非熒光降解產(chǎn)物(Hv-NCC-1)的結(jié)構(gòu)極其相似,區(qū)別在于物質(zhì)F1第Ⅱ吡咯環(huán)外的甲基并未降解變化為羰基,且第Ⅳ吡咯環(huán)側(cè)鏈上的丙酸與乙酸乙酯發(fā)生反應(yīng)。根據(jù)此推測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)進(jìn)行參考,綜合葉綠素穩(wěn)定性因素考慮,進(jìn)行葉綠素提取和分離純化時(shí),應(yīng)在密封、pH中性等條件下進(jìn)行,保障提取和純化時(shí)葉綠素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,因葉綠素降解同時(shí)需要酶的參與,也可通過改變條件影響酶活,從而達(dá)到保護(hù)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的目的[21-22]。

圖4 五種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structural formulas of five kinds of substances

2.4 純化物的抗氧化活性分析

2.4.1 純化物對(duì)DPPH·清除作用 由圖5可知,獼猴桃中各提取物對(duì)DPPH·的清除作用隨純化物質(zhì)量濃度增大而增加,在所測(cè)的各提取物中,物質(zhì)C1、D1、E1、F1對(duì)DPPH·清除效果較好,物質(zhì)B1的清除效果稍差,在質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時(shí)清除率為77.47%,活性最差的是物質(zhì)A1,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時(shí)清除率為13.97%。

圖5 獼猴桃提取物對(duì)DPPH·清除率Fig.5 Scavenging rates of different solvent extracts from Kiwifruit against DPPH· free radicals

2.4.2 純化物對(duì)DPPH·清除活性IC50值的影響 由表1可見,提取物對(duì)DPPH·清除活性IC50值的順序?yàn)?VC<物質(zhì)E1<物質(zhì)C1<物質(zhì)F1<物質(zhì)D1<物質(zhì)B1<物質(zhì)A1,IC50越小說明對(duì) DPPH·的清除效果越好,在各種提取物中C1與E1的活性最強(qiáng),略低于VC,提取活性最低的是A1,為純石油醚分離產(chǎn)物。

表1 獼猴桃提取物對(duì)DPPH·清除活性的IC50值Table 1 IC50 values of different solvent extracts from kiwifruit for scavenging DPPH· free radicals

2.5 提取物對(duì)Fe3+還原力的測(cè)定

由圖6可知,獼猴桃中提取物對(duì)Fe3+有較強(qiáng)的還原能力,物質(zhì)C1、E1、F1的還原能力與VC近似,物質(zhì)D1的還原能力稍弱,物質(zhì)A1和B1的還原能力明顯弱于VC,與DPPH·清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

圖6 獼猴桃提取物對(duì)Fe3+還原力曲線Fig.6 Ferric reducing power curves of different solvent extracts from Kiwifruit

3 結(jié)論

利用溶劑提取法和柱層析等手段分離純化得到包括葉綠素a在內(nèi)的6種高純度物質(zhì),通過質(zhì)譜得到了它們[M+H]+的準(zhǔn)確分子質(zhì)量,結(jié)合核磁共振數(shù)據(jù)推測(cè)了5種葉綠素相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。其中C1為葉綠素a,得到物質(zhì)A1的[M+H]+的分子質(zhì)量為927.6967,分子式為C55H84O7N4;物質(zhì)B1的[M+H]+的分子質(zhì)量為588.4304,分子式C34H33O5N4;物質(zhì)D1的[M+H]+的分子質(zhì)量為601.1116,分子式為C35H34O5N4,推測(cè)結(jié)構(gòu)可知為脫鎂葉綠酸a;物質(zhì)E1的[M+H]+的分子質(zhì)量為927.6985,分子式C55H84O7N4;物質(zhì)F1的[M+H]+的分子質(zhì)量為701.5039,分子式C37H38O9N4。同時(shí)通過DPPH法和Fe3+還原力法對(duì)其單品進(jìn)行了抗氧化活性研究,結(jié)果顯示E1與F1的活性最強(qiáng),在質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時(shí),DPPH·清除率分別為93.14%和93.39%,略低于VC的96.49%;在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),物質(zhì)E1與F1的吸光值均為1.92,僅次于VC的1.95,說明抗氧化性強(qiáng),與清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。