薛瑩瑩,林福興,別小妹,呂鳳霞,趙海珍,陸兆新

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

納豆激酶來自于日本傳統(tǒng)食品納豆,是一種絲氨酸蛋白酶,屬于枯草桿菌蛋白酶家族[1]。納豆激酶具有很強(qiáng)的抗血栓和溶解血栓的功能,對心血管系統(tǒng)具有多種有益作用,且安全無毒副作用[2],臨床用藥應(yīng)用前景廣闊。納豆激酶主要通過納豆枯草芽孢桿菌的發(fā)酵獲得,菌株的產(chǎn)酶性能對酶的生產(chǎn)應(yīng)用有著很大的影響。為開發(fā)可工業(yè)化生產(chǎn)、成本低廉的納豆激酶產(chǎn)品,需要進(jìn)一步提高生產(chǎn)菌的產(chǎn)酶能力。

誘變育種因其簡單、快速、有效等優(yōu)點(diǎn),被廣泛使用于發(fā)酵工業(yè)菌種的選育[3]。如李淑英等[4]采用60Co-γ射線輻照誘變獲得了納豆激酶高產(chǎn)突變菌株;薛健等[5]采用紫外誘變選育納豆激酶高產(chǎn)菌株,產(chǎn)酶活力較出發(fā)菌株提高了6.78%。近年來,常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)(atmospheric pressure room temperature plasma mutagenesis system,ARTP)技術(shù)在誘變育種中得到了廣泛的應(yīng)用[6],與其它傳統(tǒng)誘變技術(shù)相比,ARTP誘變育種技術(shù)安全性高、突變率高、條件可控性強(qiáng),可以大幅提高菌株的突變強(qiáng)度和突變庫容量[7]。如田成福等[8]通過ARTP誘變選育出高酶活突變菌株,提高了生產(chǎn)海藻糖的能力?？股乜剐院Y選方法是從微生物對抗生素的耐藥性中發(fā)展起來的菌種選育技術(shù),微生物產(chǎn)生的某些抗性突變會直接影響其次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控,從而改變其代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力和產(chǎn)量水平[9]。同時抗生素抗性篩選方法作為一種選擇性標(biāo)記的篩選方法,可以淘汰掉大量非突變菌株,減小篩菌的盲目性。如關(guān)志煒等[10]通過篩選抗高濃度利福平的菌株來篩選更多的基因突變菌株。田萍萍等[11]將ARTP誘變技術(shù)與抗生素抗性篩選相結(jié)合,獲得一株阿維菌素高產(chǎn)突變菌株,其阿維菌素產(chǎn)量比誘變前提高了23.4%。而利用ARTP技術(shù)聯(lián)合抗生素抗性選育納豆激酶高產(chǎn)菌株的育種工作尚未見報道。

本實驗室保藏的一株產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XZI125,其產(chǎn)酶能力還未達(dá)到用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌株的要求,需要進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)酶性能,本文通過對其進(jìn)行ARTP誘變,采用酪蛋白平板和利福平、卡那霉素、鏈霉素、氯霉素抗性篩選,選育納豆激酶高產(chǎn)突變菌株,以期為納豆激酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XZI125 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實驗室保藏;安佳脫脂乳粉 新西蘭;牛血纖維蛋白原、尿激酶和凝血酶 中國藥品生物制品檢定所;瓊脂糖 阿拉丁試劑有限(中國)公司;利福平、卡那霉素、鏈霉素和氯霉素 美國Sigma公司;其它試劑 均為分析純。

SW-CJ-IBU超凈臺 蘇凈集團(tuán)安泰公司;高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY公司;HYG-C型恒溫?fù)u床 太倉實驗設(shè)備廠;DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司;Orion 3 STAR pH計 美國Thermo公司;AY120型電子天平 日本島津公司;WH-3微型漩渦混勻儀 上海滬西分析儀器廠;WFJ 7200型可見分光光度計 尤尼柯上海儀器公司;游標(biāo)卡尺 上海恒量量具有限公司;Anker DL-5-B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;IIS型常壓室溫等離子體微生物誘變系統(tǒng)(ARTP) 無錫源清天木生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 斜面與固體培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%,氯化鈉0.5%,蛋白胨1.0%,瓊脂 2.0%,pH7.2,121 ℃滅菌20 min。

液體種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%,葡萄糖0.5%,氯化鈉0.5%,蛋白胨1%,pH7.2,121 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:麥芽糖1%,麩皮1%,胰蛋白胨0.5%,豆粕粉1.5%,酵母膏0.1%,MgSO40.05%,K2HPO40.25%,KH2PO40.1%,吐溫40 0.15%,pH7.2,121 ℃滅菌20 min,裝液量 50 mL/250 mL。

酪蛋白平板培養(yǎng)基:脫脂奶粉5%,瓊脂1.5%,115 ℃滅菌15 min。

1.2.2 納豆激酶活力的測定

1.2.2.1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法測定[12]。將8 mL 0.7%的瓊脂糖溶液加熱溶化至透明狀態(tài),60 ℃恒溫水浴保溫20 min,按0.8 mg/mL的量將纖維蛋白原溶于蒸餾水中,放入50 ℃恒溫水浴鍋中保溫15 min,將瓊脂糖和纖維蛋白原溶液快速混勻,同時加入50 μL 200 IU/mL的凝血酶,充分混勻后倒入直徑為9 cm的圓形培養(yǎng)皿中,待凝膠體系完全凝固后,打孔備用。

將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為50、100、200、400、600、800 IU/mL 6個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品,取各個濃度標(biāo)樣10 μL加入到瓊脂糖-纖維蛋白平板的加樣孔中,37 ℃正置培養(yǎng)18 h,用游標(biāo)卡尺測量纖維蛋白溶解圈的橫直徑和豎直徑,算出各個標(biāo)樣濃度下溶解圈的直徑積,然后以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)液溶解圈直徑積為橫坐標(biāo),尿激酶標(biāo)準(zhǔn)液酶活的對數(shù)值為縱坐標(biāo),繪制尿激酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 發(fā)酵液中納豆激酶活力的測定 發(fā)酵液經(jīng)5000 r/min離心20 min后,作適當(dāng)倍數(shù)稀釋,使得酶活測量值在標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍內(nèi),按1.2.2.1的方法測定發(fā)酵上清液的酶活,活性單位以尿激酶的活性單位 IU/mL表示。

1.2.3 菌懸液的制備 將出發(fā)菌株從斜面上取一環(huán)接種到裝有50 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶,放置于37 ℃恒溫?fù)u床中,180 r/min培養(yǎng)7～9 h至該菌株的對數(shù)期,此時是芽孢桿菌產(chǎn)胞外酶最旺盛的時期[13],用可見分光光度計在600 nm波長下檢測菌液OD600值在0.9～1.1之間,此時菌液濃度為107～108CFU/mL,菌液于4500 r/min下離心5 min,用無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀兩遍,最后用無菌生理鹽水重懸菌體,作為待誘變處理的菌懸液。

1.2.4 ARTP誘變 將ARTP育種儀自帶的金屬載片移至超凈臺中,用鑷子將其放在酒精燈火焰上灼燒滅菌,然后放入滅菌過的平板中,取10 μL含5%甘油的菌懸液,均勻涂于金屬載片上,蓋上平板蓋,將平板移至ARTP誘變系統(tǒng)操作倉,按照ARTP生物育種儀的操作流程,以高純氦氣為氣源,設(shè)定功率為100 W,氣流量10 SLM,載片與氣流端口距離為2 mm,設(shè)置處理時間0、15、30、45、60、90、120、160 s;待誘變完成后,立即用無菌生理鹽水洗脫附著在載片上的菌體,形成新的菌懸液,振蕩均勻,并作適當(dāng)稀釋涂布于酪蛋白初篩平板上,每個處理時間做3次重復(fù),37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,觀察菌落生長情況,進(jìn)行平板菌落計數(shù),按下式計算出菌株致死率和正突變率,在正突變率計算中,考慮系統(tǒng)誤差存在的情況下,挑選出的突變株初次搖瓶發(fā)酵驗證得到的酶活值高于對照組10%,即視為正突變菌株。

致死率(%)=(對照組菌落總數(shù)-誘變處理組菌落總數(shù))/對照組菌落總數(shù)

正突變率(%)=正突變株的菌落數(shù)/處理后長出的菌落總數(shù)

1.2.5 抗生素最小抑菌濃度(MIC)的測定 將出發(fā)菌株 XZI125 的菌懸液經(jīng)適度稀釋,取0.1 mL分別涂布在含有利福平(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μg/mL)、卡那霉素(10、20、30、40、50、60 μg/mL)、鏈霉素(20、30、40、50、60、70 μg/mL)、氯霉素(100、150、200、250、300、350 μg/mL)的固體平板上,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,以不含抗生素的平板上菌體的生長狀況為對照,觀察并記錄未長出菌落的各個抗生素的最低濃度,即為該抗生素的MIC,然后按其各自的MIC作為添加水平制作這四種抗生素抗性篩選平板。

1.2.6 高產(chǎn)突變株的篩選 將經(jīng)過ARTP誘變后的菌懸液經(jīng)過適當(dāng)稀釋后涂布于酪蛋白平板上,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,挑取酪蛋白平板上蛋白溶解圈直徑與菌落直徑比較大的單菌落;并將不經(jīng)稀釋的菌懸液分別涂布在含利福平、卡那霉素、鏈霉素、氯霉素的四種抗性平板上,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,觀察菌落生長情況,挑選出平板上單菌落大、形態(tài)規(guī)則、生長狀況良好的單菌落,將所有挑選出的疑似高產(chǎn)突變株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗證:將該菌株處于對數(shù)期的種子液按2%的接種量接種于盛有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,在37 ℃恒溫?fù)u床中180 r/min 搖瓶發(fā)酵5 d,發(fā)酵液按1.2.2所述方法測酶活值。

1.2.7 高產(chǎn)突變株遺傳穩(wěn)定性的測定 將篩選出的高產(chǎn)突變菌株以試管斜面形式在4 ℃冰箱保藏,傳代活化時,從冰箱的斜面直接挑取一環(huán),劃線在新鮮的斜面上,然后將斜面在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,共轉(zhuǎn)接傳代30次,每隔5代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,測定其產(chǎn)納豆激酶的活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0和Origin 9.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的顯著性分析和回歸性分析,納豆激酶酶活值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(AVE±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)纖維蛋白平板法測得的溶解圈的直徑積來表示納豆激酶的活性,這種測酶活的方法因簡便、有效而常用[14]。本研究以尿激酶標(biāo)品溶解圈的直徑積為橫坐標(biāo),尿激酶標(biāo)品的酶活的對數(shù)值為縱坐標(biāo),得到尿激酶酶活值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1可知,在0～1000 IU范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)酶活的對數(shù)值與溶解圈的直徑積之間呈線性關(guān)系,回歸分析得出的回歸方程為y=1.5454x+0.1976,決定系數(shù)為0.9945。

圖1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of urokinase

2.2 ARTP誘變結(jié)果

2.2.1 ARTP處理時間的確定 用0～200 s不同時間劑量對出發(fā)菌株BacillussubtilisXZI125進(jìn)行ARTP誘變,結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出,菌株的致死率隨處理時間的延長而提高,而正突變率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。由于等離子體可以產(chǎn)生活性粒子破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[15],長時間處理使得等離子體穿透細(xì)菌細(xì)胞壁,破壞基因、蛋白等,使得大部分微生物死亡,而少數(shù)通過自身的自動修復(fù)系統(tǒng)得以存活,并在此過程中發(fā)生基因突變[7],因此過長的處理時間對菌體有明顯的致死效果,且伴隨較高的負(fù)突變率,不利于選種。當(dāng)處理時間達(dá)到200 s時,致死率達(dá)到最大為99%,此時正突變率偏低為4.7%;當(dāng)誘變處理時間為90 s時,其致死率為83%,達(dá)到最高正突變率為8%,正突變率高則有利于菌種的篩選,故選擇90 s作為誘變處理時間。

圖2 枯草芽孢桿菌XZI125的ARTP誘變致死率及正突變率Fig.2 The fatality rate and positive mutation rate ofBacillus subtilis XZI125 treated by ARTP

2.2.2 抗生素抗性篩選濃度的確定

2.2.2.1 利福平的MIC 利福平的抗菌機(jī)制主要通過抑制細(xì)菌依賴于DNA的RNA聚合酶,阻礙 mRNA合成,從而阻斷RNA的轉(zhuǎn)錄,使DNA和蛋白質(zhì)的合成終止[16],因此可以通過篩選抗更高濃度利福平的菌株獲得RNA聚合酶突變株,以提高轉(zhuǎn)錄水平,增加酶產(chǎn)量。

表1 利福平對枯草芽孢桿菌XZI125生長的影響Table 1 Effect of rifampicin on the growth of Bacillus subtilis XZI125

如表1所示,枯草芽孢桿菌XZI125在添加利福平的平板培養(yǎng)基中,隨著利福平濃度的增加,單菌落數(shù)目減少,添加濃度為0.7 μg/mL時,無菌落生長,此濃度即為利福平對出發(fā)菌株的MIC。

2.2.2.2 卡那霉素的MIC 卡那霉素通過與細(xì)菌的核糖體30S亞基結(jié)合,影響蛋白質(zhì)合成的多個環(huán)節(jié)[16],枯草芽孢桿菌XZI125在添加卡那霉素的平板培養(yǎng)基上的生長情況如表2所示,添加濃度為50 μg/mL時,無菌落生長,此濃度即為卡那霉素對出發(fā)菌株的MIC。

表2 卡那霉素對枯草芽孢桿菌XZI125生長的影響Table 2 Effect of kanamycin on the growth of Bacillus subtilis XZI125

2.2.2.3 鏈霉素的MIC 鏈霉素抗性篩選具有正突變率高、增產(chǎn)百分率高等特點(diǎn)[9]。鏈霉素對枯草芽孢桿XZI12生長的抑制作用如表3所示,在添加濃度為60 μg/mL時,無菌落生長,此濃度即為鏈霉素對出發(fā)菌株的MIC。

表3 鏈霉素對枯草芽孢桿菌XZI125生長的影響Table 3 Effect of streptomycin on the growth of Bacillus subtilis XZI125

2.2.2.4 氯霉素的MIC 氯霉素通過與細(xì)菌的核糖體50S亞基結(jié)合,阻礙轉(zhuǎn)肽酰酶的作用,從而使新肽鏈的形成受阻,抑制蛋白質(zhì)合成[16]。氯霉素對枯草芽孢桿XZI125生長的抑制作用如表4所示,在添加濃度為300 μg/mL時,無菌落生長,此濃度即為氯霉素對出發(fā)菌株的MIC。

表4 氯霉素對枯草芽孢桿菌XZI125生長的影響Table 4 Effect of chloramphenicol on the growth of Bacillus subtilis XZI125

2.2.3 高產(chǎn)突變株篩選結(jié)果 菌株XZI125經(jīng)ARTP誘變后,在酪蛋白初篩平板上共得到276株透明圈清晰的菌株。挑取其中38株蛋白溶解圈直徑與菌落直徑比較大的單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗證,得到3株高產(chǎn)菌,正突變率為7.9%。其中1株高產(chǎn)突變株A27,測得其搖瓶發(fā)酵液酶活值為3068 IU/mL,比原始菌株酶活力(2490 IU/mL)提高了23.2%。

將誘變后的菌懸液涂于四種抗生素抗性平板上,共計挑選了59株ARTP誘變結(jié)合抗生素抗性的菌,其中有14株正突變菌,正突變率達(dá)到23.7%,其中一株最高產(chǎn)菌Ar 41比原始菌的產(chǎn)酶能力提高了26.6%。相比于經(jīng)ARTP誘變后通過酪蛋白平板法初篩挑取的菌株,用抗生素抗性平板篩選的方法,正突變率更高。且結(jié)果顯示,一共得到的17株高產(chǎn)突變菌中,只有17.6%來源于酪蛋白平板的挑選,82.4%的高產(chǎn)突變株來源于ARTP誘變結(jié)合抗生素抗性平板的篩選。表5列出了酶活提高20%以上的7株高產(chǎn)突變菌株,其中2株來自酪蛋白平板的篩選,5株來自抗性平板的篩選。

表5 高產(chǎn)納豆激酶突變菌株的產(chǎn)量Table 5 Production of high-yield nattokinase strains

在14株從抗生素抗性平板上挑選的高產(chǎn)菌株中,其中最高產(chǎn)菌株Ar 41的篩選來自于利福平抗性平板,在卡那霉素抗性平板上只篩選到1株高產(chǎn)菌株。誘變處理后的菌懸液在抗性平板上大都呈稀密度菌落分布狀態(tài),且菌落一般比較小,形態(tài)較不規(guī)則,篩選時選擇菌落較大、形態(tài)規(guī)則、生長狀況良好的菌株,縮小了篩選的選擇范圍。分析在抗性平板上篩選到的高產(chǎn)菌株可能是因為ARTP誘變過程使菌株發(fā)生產(chǎn)酶性能提高的正突變,同時菌株的突變可能導(dǎo)致對某些抗生素的抗性提高;或是因為抗生素抗性的引入導(dǎo)致了菌株產(chǎn)酶能力增強(qiáng),如Kurosawa等[17]通過引入鏈霉素抗性突變得到了高產(chǎn)α-淀粉酶和蛋白酶的枯草芽孢桿菌突變株。

2.2.4 高產(chǎn)突變株的遺傳穩(wěn)定性 突變菌株在傳代過程中可能出現(xiàn)表型延滯現(xiàn)象,會導(dǎo)致篩選到的高產(chǎn)菌株轉(zhuǎn)接多次后發(fā)酵產(chǎn)能下降,故需要對突變菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行驗證試驗。Ma等[18]對經(jīng)ARTP誘變后的枯草芽孢桿菌突變體WB600 mut-12#進(jìn)行了多次傳代培養(yǎng),其表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。本研究對篩選到的NK高產(chǎn)突變菌進(jìn)行30代遺傳穩(wěn)定性驗證實驗,通過6輪復(fù)篩驗證,得到3株遺傳穩(wěn)定的突變菌A27、Ar41和Ac35,其發(fā)酵酶活力相對效價分別為123.0%、125.1%、126.5%,相對于原始菌株酶活力分別提高23.0%、25.1%、26.5%。從圖3中可以看出這三株菌有相對穩(wěn)定的遺傳特性,故可作為后續(xù)試驗的出發(fā)菌株。

圖3 出發(fā)菌株、A27、Ar41和Ac35每代搖瓶發(fā)酵酶活力相對效價Fig.3 The relative potency of enzyme activity of every generation by initial strain,A27,Ar41 and Ac35

3 結(jié)論

本研究對原始菌株BacillussubtilisXZI125采用ARTP誘變的方式結(jié)合抗生素抗性篩選,篩選出3株穩(wěn)定高產(chǎn)菌株,分別是A27、結(jié)合了利福平抗性的Ar41和結(jié)合了氯霉素抗性的Ac35,經(jīng)過30次傳代培養(yǎng)后,相對于原始菌株酶活力分別提高了23.0%、25.1%、26.5%。比較酪蛋白平板篩選方法和0.7 μg/mL利福平、50 μg/mL卡那霉素、60 μg/mL鏈霉素、300 μg/mL氯霉素四種抗性篩選方法,結(jié)果顯示抗生素抗性篩選方法更有利于NK高產(chǎn)菌株的篩選。在用抗生素抗性篩選方法的過程中,可能由于誘變的隨機(jī)性,并未發(fā)現(xiàn)經(jīng)ARTP誘變后的高產(chǎn)菌株和其對這四種抗生素產(chǎn)生抗性之間存在何種相關(guān)性。今后的研究中,可進(jìn)一步研究更有效、更好的篩選方法,也可對突變菌的代謝特性作深入研究,探索高產(chǎn)突變株的最佳培養(yǎng)條件,進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶量,為促進(jìn)納豆激酶作為溶栓劑的開發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)支持。