,*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工設(shè)計(jì)研究所,海南?？?571100; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070; 3.江西生物科技職業(yè)學(xué)院,江西南昌 330200)

巴戟天(MorindaofficinalisHow)亦稱雞腸風(fēng)、雞腿藤,屬于茜草科(Rubiaceae)巴戟天屬植物[1],是我國“四大南藥”之一,主要分布在廣東、廣西、海南、福建等地。巴戟天中含有多糖、有機(jī)酸、環(huán)稀醚萜苷類、揮發(fā)油等多種營養(yǎng)成分,具有抗抑郁[2-3]、降血糖[4]、補(bǔ)腎陽[5]、緩解骨質(zhì)疏松[6-7]以及增強(qiáng)免疫力[8]等多種生物活性。多糖是巴戟天的主要活性成分之一,含量高達(dá)13.45%～24.37%[9]。

目前,國內(nèi)對巴戟天抗骨質(zhì)疏松活性方面進(jìn)行了一些研究,如朱孟勇等[10]研究表明巴戟天多糖能夠提高切除卵巢后骨質(zhì)疏松大鼠骨密度;姜克明[11]研究表明巴戟天糖聚物能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。這些研究主要說明,巴戟天多糖具有預(yù)防骨質(zhì)疏松作用。目前,未對其促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖的具體指標(biāo)進(jìn)行全面評價,未測定其理化性質(zhì),這不利于巴戟天多糖的深入研究與應(yīng)用。因此,本試驗(yàn)以海南產(chǎn)巴戟天為原料,在纖維素酶輔助提取巴戟天多糖的基礎(chǔ)上,通過化學(xué)和儀器分析法研究巴戟天多糖的pH、相對黏度、溶解性、光譜特征、空間構(gòu)像等理化性質(zhì);采用噻唑藍(lán)法和酶聯(lián)免疫法,研究其對MC3T3-E1細(xì)胞增殖率、Ⅰ型膠原蛋白(collagen typeⅠ,COLⅠ)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)分泌量及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影響,以期為巴戟天應(yīng)用于預(yù)防治療骨質(zhì)疏松方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴戟天 產(chǎn)自海南省五指山市;小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1 美國菌種保藏中心;纖維素酶(400 U/mg) Sigma公司;胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基 Gibco公司;堿性磷酸酶檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;噻唑藍(lán)(MTT) 阿拉丁試劑有限公司;乙醇、氯仿、正丁醇、硫酸、苯酚等 廣州化學(xué)試劑廠。

680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司;TU-1810分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;TH2-C-1搖床 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;FLBP-1000A型粉碎機(jī) 上海菲力博食品機(jī)械有限公司;雷磁PHSJ-4F型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;CPA225D電子天平 德國Sartorius公司;NDJ-5S旋轉(zhuǎn)黏度計(jì) 上海越屏科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 巴戟天多糖提取 在前期研究的基礎(chǔ)上,提取巴戟天多糖。將巴戟天洗凈,置于50 ℃下烘36 h,粉碎,過40目篩,經(jīng)乙醚脫脂后,進(jìn)行多糖提取纖維素酶用量1500 U/g、溫度50 ℃、pH5.0、底物質(zhì)量濃度50 g/L,時間1.5 h,浸提,抽濾,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,95%乙醇沉至終濃度70%,活性炭脫色2次,Sevage試劑(正丁醇∶氯仿=4∶1)脫蛋白4次,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,真空冷凍干燥,得到巴戟天多糖提取物。

1.2.2 巴戟天多糖提取物的理化性質(zhì)測定

1.2.2.1 pH和相對黏度測定 配制2 mg/mL多糖水溶液(25 ℃),pH計(jì)測定5 min內(nèi)的穩(wěn)定數(shù)值,即為巴戟天多糖的pH[12]。配制10 mg/mL巴戟天多糖水溶液,測定黏度(25 ℃),同時測定去離子水黏度,計(jì)算相對黏度(μr),μr=巴戟天多糖水溶液黏度(μ)/去離子水黏度(μs)[13]。

1.2.2.2 化學(xué)成分分析 依次采用硫酸-苯酚法[14]、碘-碘化鉀反應(yīng)、斐林試劑反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)測定巴戟天多糖提取物[15],判斷其是否含有多糖、淀粉、還原糖、氨基酸或蛋白質(zhì)。

1.2.2.3 多糖溶解性測定 將巴戟天多糖提取物配成2 mg/mL溶液,分別置于(20、40、60、80、100 ℃)下水浴溶解,磁力攪拌(150 r/min),測定巴戟天多糖的完全溶解時間[16]。

1.2.2.4 紫外光譜特征測定 配制0.5 mg/mL巴戟天多糖溶液,以蒸餾水為空白,利用紫外分光光度計(jì)在波長200～400 nm范圍內(nèi)測定吸光值,繪制巴戟天多糖紫外光譜特征曲線[17]。

1.2.2.5 空間構(gòu)象分析 采用剛果紅實(shí)驗(yàn)[18]分析多糖樣品空間構(gòu)象。稱取多糖樣品5～10 mg,加蒸餾水2 mL、80 μmol/L剛果紅試劑2 mL。加入1 mol/L的NaOH溶液,至溶液NaOH終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mol/L,于200～800 nm光譜掃描,測量不同NaOH濃度下溶液最大吸收波長。以蒸餾水作為空白對照,比較反應(yīng)體系的最大吸收波長變化情況。

1.2.3 巴戟天多糖對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

1.2.3.1 MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性測定 參考夏光華等[19]方法,用α-MEM培養(yǎng)基將對數(shù)期MC3T3-E1細(xì)胞濃度調(diào)整為1.5×104個/mL,每孔100 μL接種至96孔板中,培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基,加入巴戟天多糖提取物,濃度為(0、6.25、12.5、25、50 μg/mL),每孔加入200 μL,培養(yǎng)72 h后。在測定前4 h加入MTT溶液(終濃度0.5 mg/mL),培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)液,加入200 μL酸化異丙醇,充分吹打,使藍(lán)色結(jié)晶完全溶解,570 nm測定處吸光值。MC3T3-E1細(xì)胞增殖率按照下列公式計(jì)算:

細(xì)胞增殖活性(%)=(樣品吸光值/空白吸光值)×100

1.2.3.2 MC3T3-E1細(xì)胞COL Ⅰ和OCN含量測定 取密度為2×104個/mL的MC3T3-E1細(xì)胞接種于24孔板,每孔1 mL,24 h后,換濃度為(0、6.25、12.5、25、50 μg/mL)巴戟天多糖提取液,培養(yǎng)7 d后,收集培養(yǎng)液,按照酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒方法檢測COLⅠ和OCN含量。

1.2.3.3 MC3T3-E1細(xì)胞ALP活力測定 參考陳宏杰等[20]方法,取細(xì)胞濃度為9×104個/mL的MC3T3-E1細(xì)胞接種于12 孔板中,每孔接種1 mL,待48 h后,分別用質(zhì)量濃度為(0、6.25、12.5、25、50 μg/mL)的巴戟天多糖提取物干預(yù),培養(yǎng)誘導(dǎo)分化5 d,去除培養(yǎng)液,用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% TritonX-100的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,取上清液,根據(jù)堿性磷酸酶檢測試劑盒的說明操作測定該上清液的ALP活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測定所得數(shù)據(jù)均重復(fù)三次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0軟件、Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,Origin 8.5軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴戟天多糖的理化性質(zhì)

2.1.1 pH和相對黏度 巴戟天多糖提取物pH為6.15±0.13,呈弱酸性,可能是巴戟天多糖含有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)[15]、糖醛酸、硫酸根等基團(tuán)[21],使溶液呈弱酸性。巴戟天多糖提取物相對黏度1.26±0.12,與文獻(xiàn)報道的多糖相對黏度相符,如與李然等[17]測定的白三葉多糖相對黏度(1.24±0.09)相似,其相對黏度的差異可能與巴戟天多糖化合物的大小、結(jié)構(gòu)、所帶凈電荷有關(guān)。

2.1.2 化學(xué)成分分析 巴戟天多糖提取物中若含有淀粉、還原糖、蛋白質(zhì)、氨基酸成分,會對其活性產(chǎn)生不利影響。通過化合物中官能團(tuán)與某些試劑發(fā)生特征反應(yīng),產(chǎn)生不同顏色或沉淀來判斷提取物中是否含有上述化合物。巴戟天多糖提取物與硫酸-苯酚反應(yīng)呈紅棕色,進(jìn)一步驗(yàn)證其具有多糖的特性;與碘-碘化鉀無藍(lán)色現(xiàn)象,說明其未含有淀粉;與斐林試劑反應(yīng)無磚紅色沉淀生成,說明不含有還原糖;與茚三酮反應(yīng)無顯色反應(yīng),說明不含氨基酸或蛋白質(zhì)。

2.1.3 溶解性 不同溫度下測定巴戟天多糖提取物的溶解時間如圖1所示。從圖1可知,隨著溫度升高,巴戟天多糖的溶解時間逐漸減少,100 ℃時,巴戟天多糖的溶解時間僅為(3.55±0.25) min,溶解效率最高,這可能是因?yàn)闇囟壬?分子運(yùn)動加劇,利于多糖溶解。這與李然等[17]測定的白三葉多糖溶解性變化趨勢相似,但溶解時間隨溫度的變化有一定差別,這可能與原料自身性質(zhì)有關(guān)。

圖1 巴戟天多糖溶解性Fig.1 Solubility of polysaccharides from Morinda officinalis How

2.1.4 巴戟天多糖紫外光譜圖 巴戟天多糖提取物的紫外光譜圖如圖2所示。從圖2可知,巴戟天多糖提取物在260、280 nm處均無吸收峰,說明不含核酸、蛋白質(zhì),該結(jié)果與2.1.2茚三酮反應(yīng)結(jié)果一致。

圖2 巴戟天多糖紫外光譜圖Fig.2 UV spectrum of polysaccharide from Morinda officinalis How

2.1.5 空間構(gòu)象 多糖的活性與多糖分子一級、空間結(jié)構(gòu)有關(guān),三股螺旋結(jié)構(gòu)是多糖分子中最具活性的空間構(gòu)象[22]。在低濃度NaOH溶液下,剛果紅可與具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的多糖形成絡(luò)合物,溶液最大吸收波長增加;較高NaOH溶液下,三股螺旋結(jié)構(gòu)解開,不能形成絡(luò)合物,溶液最大吸收波長下降[23],因此,可通過剛果紅試驗(yàn),推測多糖是否具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。由圖3可知,當(dāng)NaOH濃度為0～0.3 mol/L,巴戟天多糖樣品最大吸收波長向長波方向移動;當(dāng)NaOH濃度大于0.3 mol/L,最大吸收波長下降,說明巴戟天多糖在較低堿濃度條件下,以有序的三股螺旋結(jié)構(gòu)存在;堿濃度較高時,分子間氫鍵破壞,多糖三股螺旋結(jié)構(gòu)解體,不能與剛果紅形成絡(luò)合物,由此推測巴戟天多糖提取物具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖3 不同NaOH濃度剛果紅-巴戟天多糖絡(luò)合物紫外光譜最大吸收波長Fig.3 UV spectrum maximum absorption wavelength of Congo red-polysaccharides from Morinda officinalisHow at various NaOH concentrations

2.2 巴戟天多糖提取物對MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響

2.2.1 巴戟天多糖提取物對MC3T3-E1細(xì)胞增殖率的影響 成骨細(xì)胞在調(diào)控骨形成和骨吸收平衡中起著非常重要的作用。在骨形成過程中,成骨細(xì)胞要經(jīng)歷增殖、分化、礦化等階段[24]。細(xì)胞增殖率是成骨細(xì)胞不同時期增殖的直觀表現(xiàn),增殖率越高,說明增殖活性越強(qiáng),促進(jìn)骨形成能力越強(qiáng)[19],具有潛在改善骨代謝或骨質(zhì)疏松作用。由圖4可知,巴戟天多糖提取物可以明顯提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞增殖活性,呈明顯量效依賴關(guān)系。當(dāng)巴戟天多糖提取物濃度大于12.5 μg/mL時,MC3T3-E1細(xì)胞增殖率與對照組相比呈極顯著增加(P<0.01),且在濃度為50 μg/mL時,MC3T3-E1細(xì)胞增殖率達(dá)到149.67%,明顯優(yōu)于夏光華等[19]純化鯽魚卵唾液酸糖蛋白(濃度400 μg/mL時,增殖率153.57%)和陳宏杰等[20]制備的雞蛋黃蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物(濃度1 mg/mL時,增殖率129.87%),這可能是因?yàn)榘完於嗵翘崛∥锬苡行Т龠M(jìn)成骨細(xì)胞有絲分裂,抑制成骨細(xì)胞凋亡[25],且濃度越高,相對應(yīng)的促進(jìn)和抑制作用越強(qiáng)。

圖4 巴戟天多糖提取物對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of polysaccharides extracted fromMorinda officinalis How on proliferation of MC3T3-E1 cells 注:*表示與對照組相比,差異顯著(P<0.05),**表示與對照組相比,差異極顯著(P<0.01),圖5～圖7同。

2.2.2 巴戟天多糖提取物對MC3T3-E1細(xì)胞分泌COLⅠ的影響 COLⅠ是骨組織形成的先決條件和成骨細(xì)胞早期分化標(biāo)志[26]。如圖5所示,巴戟天多糖提取物能夠明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分泌COL Ⅰ,呈量效依賴關(guān)系。當(dāng)巴戟天提取物濃度為12.5 μg/mL時,COLⅠ分泌量與對照組相比呈顯著增加(P<0.05);當(dāng)濃度為25、50 μg/mL時,COLⅠ分泌量與對照組相比呈極顯著增加(P<0.01),且在質(zhì)量濃度為50 μg/mL時,COLⅠ分泌量較對照組提高44.98%,可能是巴戟天多糖提取物能有效促進(jìn)骨基質(zhì)膠原的合成[27],且濃度越高,促進(jìn)作用越強(qiáng)。表明巴戟天多糖提取物對MC3T3-E1細(xì)胞分泌COLⅠ具有明顯促進(jìn)作用。

圖5 巴戟天多糖提取物對MC3T3-E1細(xì)胞分泌COLⅠ的影響Fig.5 Effects of polysaccharides extracted fromMorinda officinalis How on COLⅠsecretion of MC3T3-E1 cells

2.2.3 巴戟天多糖提取物對MC3T3-E1細(xì)胞OCN含量的影響 OCN是成骨細(xì)胞特異合成和分泌的一種非膠原蛋白,具有維持骨組織正常礦化作用,是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志物[28-29]。如圖6所示,巴戟天多糖提取物對MC3T3-E1細(xì)胞分泌OCN具有顯著促進(jìn)作用,當(dāng)質(zhì)量濃度為6.25 μg/mL時,OCN分泌量與對照組相比呈顯著增加(P<0.05);當(dāng)質(zhì)量濃度大于12.5 μg/mL時,OCN分泌量與對照組相比呈極顯著增加(P<0.01),且當(dāng)濃度為50 μg/mL時,OCN的分泌量較對照組增加85.01%,可能是巴戟天多糖提取物能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞核心結(jié)合因子表達(dá),促進(jìn)OCN分泌[30]。表明巴戟天多糖提取物能夠顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分泌OCN。

圖6 巴戟天多糖提取物對MC3T3-E1細(xì)胞分泌OCN的影響Fig.6 Effects of polysaccharides extracted fromMorinda officinalis How on OCN secretion of MC3T3-E1 cells

2.2.4 巴戟天多糖提取物對MC3T3-E1細(xì)胞中ALP活力的影響 ALP是成骨細(xì)胞分泌的同源二聚體糖蛋白,特異性高,是成骨細(xì)胞分化成熟的主要標(biāo)志之一。ALP活性升高,表示成骨細(xì)胞活動增強(qiáng)[28,31]。由圖7可知,隨著巴戟天多糖質(zhì)量濃度增加,ALP活力增加,二者呈量效依賴關(guān)系。當(dāng)巴戟天多糖提取物濃度大于12.5 μg/mL時,ALP活力與對照組相比呈極顯著提高(P<0.01),且當(dāng)濃度為50 μg/mL時,ALP活力較對照組提高了258.95%,優(yōu)于Ji等[32]提取的雞蛋卵黃水溶性蛋白(142.4%±13.6%),可能是巴戟天多糖提取物能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,提高ALP活力[25],且濃度越高,促進(jìn)作用越強(qiáng)。表明巴戟天多糖提取物可以明顯提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞ALP活力。

圖7 巴戟天多糖提取物對MC3T3-E1細(xì)胞中ALP的影響Fig.7 Effects of polysaccharides extracted fromMorinda officinalis How on ALP activity of MC3T3-E1 cells

3 結(jié)論

巴戟天多糖屬于酸性多糖,pH為6.15±0.13,相對黏度為1.26±0.12,具有糖的特性和三股螺旋結(jié)構(gòu),溶解性較好,不含蛋白質(zhì)或多肽。與對照組相比,巴戟天多糖提取物濃度為50 μg/mL時,MC3T3-E1細(xì)胞增殖率極顯著增加(P<0.01),為對照組的149.67%,COLⅠ分泌量、OCN的分泌量、ALP活性極顯著提高(P<0.01),分別提高了44.98%、85.01%和258.95%,說明巴戟天多糖提取物能明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖與分化,具有潛在改善骨代謝或骨質(zhì)疏松作用,有望開發(fā)成預(yù)防骨質(zhì)疏松產(chǎn)品。