王向鵬，左百樂(lè)，王冠玉，陳園坤，楊安鋼，2

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 河南省分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞(chimeric antigen receptor modified T cell，CAR-T)免疫療法是一種細(xì)胞治療技術(shù)，其原理是通過(guò)分離培養(yǎng)患者自身T細(xì)胞，利用基因工程技術(shù)改造T細(xì)胞，使其表達(dá)可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞且同時(shí)可以激活T細(xì)胞的嵌合抗體，將改造后的T細(xì)胞(即CAR-T)經(jīng)體外擴(kuò)增后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，通過(guò)CAR-T表面表達(dá)的抗體特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，同時(shí)激活下游信號(hào)通路，使CAR-T在體內(nèi)活化、增殖，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。該技術(shù)自1989年由GROSS等[1]首次提出，至今已經(jīng)歷了30 a的發(fā)展。2011年美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)JUNE教授利用CAR-T技術(shù)，以CD19分子為靶點(diǎn)成功治愈了晚期慢性B淋巴細(xì)胞白血病患者，自此開(kāi)創(chuàng)了CAR-T治療腫瘤的新紀(jì)元[2]。2017年8月30日，美國(guó)食品藥品管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)首次批準(zhǔn)諾華公司的CTL019(Kymriah)用于治療兒童和年輕成人急性淋巴細(xì)胞白血病。同年10月，美國(guó)FDA宣布批準(zhǔn)了Kite Pharma公司的Yescarta (axicabtagene ciloleucel)上市，用于治療罹患特定類(lèi)型的成人大B細(xì)胞淋巴瘤，這是全球第2個(gè)獲批的CAR-T療法。這2種CAR-T療法的上市，標(biāo)志著血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療新時(shí)代的到來(lái)[3]。

鑒于CAR-T治療技術(shù)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療方面的重大突破，許多學(xué)者將CAR-T技術(shù)用于實(shí)體腫瘤的治療。由于實(shí)體腫瘤的特殊性，CAR-T免疫療法治療實(shí)體腫瘤的療效并不像治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤一樣理想；但是，越來(lái)越多的研究證實(shí)，CAR-T也可以用于實(shí)體腫瘤的治療[4]。本文對(duì)CAR-T免疫療法在實(shí)體腫瘤治療領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，同時(shí)對(duì)其研究趨勢(shì)進(jìn)行展望。

1 嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)的結(jié)構(gòu)

典型的CAR結(jié)構(gòu)包括1個(gè)細(xì)胞外腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)、1個(gè)鉸鏈區(qū)、1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。細(xì)胞外腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)一般是靶向腫瘤相關(guān)抗原的單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)，而scFv決定了CAR-T的特異性。鉸鏈區(qū)序列一般來(lái)源于免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G1、IgG4、IgD 和CD8分子的鉸鏈區(qū)，其大小會(huì)影響scFv的靈活性?？缒^(qū)一般來(lái)自T細(xì)胞的CD3ζ、CD4、CD8、CD28分子的跨膜區(qū)序列。胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的主要作用是激活T細(xì)胞，常用的分子為CD3ζ、CD28、CD27、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)等分子的胞內(nèi)區(qū)序列。自1989年GROSS等[1]設(shè)計(jì)出第1代CAR到現(xiàn)在，該技術(shù)已經(jīng)歷了4代革新。第1代CAR只有1個(gè)胞內(nèi)信號(hào)分子，最常用的是CD3ζ的胞內(nèi)片段，由于缺少共刺激分子，其轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞增殖的信號(hào)有限，因此，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果并不十分理想。第2代CAR增加了共刺激分子，如CD28、4-1BB和OX40等，由于存在共刺激信號(hào)，CAR-T可以充分活化，顯著提高了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。目前，第2代CAR基本上可以滿(mǎn)足臨床需要。第3代CAR在第2代CAR的基礎(chǔ)上增加了1個(gè)共刺激信號(hào)，由于胞內(nèi)區(qū)有2個(gè)共刺激信號(hào)分子，CAR在體內(nèi)的增殖能力和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力又得到了進(jìn)一步提高。第4代CAR是在第3代CAR的基礎(chǔ)上增加了促炎性細(xì)胞因子或共刺激分子的配體，其可以招募其他細(xì)胞因子進(jìn)而放大局部腫瘤的免疫效應(yīng)，主要用于實(shí)體腫瘤的治療[5]。

2 實(shí)體腫瘤靶點(diǎn)的選擇

CAR-T治療實(shí)體腫瘤面臨的首要挑戰(zhàn)是靶點(diǎn)的選擇。理想的靶點(diǎn)是只在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，而在其他細(xì)胞中不表達(dá)。CAR-T在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中取得了非常理想的療效，很重要的原因之一是血液腫瘤細(xì)胞有特異性的靶點(diǎn)，如CD19分子。實(shí)體腫瘤細(xì)胞特異性靶點(diǎn)較少，目前應(yīng)用的實(shí)體腫瘤靶點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較高，但在正常組織中也有表達(dá)，CAR-T在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，不可避免地會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷。盡管如此，越來(lái)越多的針對(duì)實(shí)體腫瘤靶點(diǎn)的CAR-T療法已經(jīng)開(kāi)展，并取得了一定療效。ZHANG等[6]制備了針對(duì)癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)的CAR-T，對(duì)10例CEA陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者注射不同劑量的CAR-T，其中7例患者病情趨于穩(wěn)定，2例患者病情穩(wěn)定期超過(guò)30周，2例患者腫瘤體積明顯縮小。也有學(xué)者通過(guò)靶向雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(disialoganglioside，GD2)治療腦膠質(zhì)瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者。MOUNT等[7]制備了針對(duì)GD2的CAR-T，體外實(shí)驗(yàn)證明其可以殺傷腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在小鼠體內(nèi)可以清除腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，這為治療腦膠質(zhì)瘤提供了一種新方法。LOUIS等[8]采用針對(duì)GD2的CAR-T治療19例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者，8例患者臨床癥狀得以緩解，3例患者臨床癥狀幾乎得到了完全緩解。AHMED等[9]以人表皮生長(zhǎng)因子受體(human epidermal growth factor receptor,Her)2為靶點(diǎn)治療19例Her2陽(yáng)性肉瘤患者，3例患者腫瘤完全消失，4例患者臨床癥狀得到緩解，患者的平均中位生存期達(dá)到了10.3個(gè)月；BROWN等[10]利用靶向白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-13受體α的CAR-T首次在患者體內(nèi)清除了神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。此外，還有通過(guò)靶向間皮素治療胰腺癌[11-12]，通過(guò)靶向CD70治療頭頸部鱗癌和膠質(zhì)瘤[13-14]，通過(guò)靶向表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)治療非小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[15-16]，通過(guò)靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3治療肝細(xì)胞癌[17]等。盡管CAR-T治療實(shí)體腫瘤的效果不如治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的效果一樣理想，但目前的研究已經(jīng)看到了CAR-T治療實(shí)體腫瘤的前景。

EGFR家族成員是許多實(shí)體腫瘤比較明確的靶標(biāo)。EGFR是一種廣泛存在于人體表皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的具有酪氨酸激酶活性的膜表面受體，其家族主要包括Her1(EGFR)、Her2、Her3和Her4 4個(gè)成員。目前，Her3已作為新的腫瘤治療靶點(diǎn)受到越來(lái)越多學(xué)者的重視[18-19]。Her3在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、頭頸癌、卵巢癌、胃癌和膀胱癌等多種惡性實(shí)體腫瘤中的表達(dá)均上調(diào)，通過(guò)配體依賴(lài)和非依賴(lài)途徑參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[20-21]。Her3被認(rèn)為是一個(gè)促進(jìn)腫瘤發(fā)生的細(xì)胞因子[22]，其本身無(wú)酪氨酸激酶活性，而Her2無(wú)配體結(jié)合，二者需要與其他受體結(jié)合形成異二聚體才能發(fā)揮作用，其中Her3/Her2異二聚體是Her家族信號(hào)傳導(dǎo)能力最強(qiáng)的二聚體，可以激活腫瘤細(xì)胞的絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶通路促進(jìn)細(xì)胞增殖，使細(xì)胞生長(zhǎng)失控和惡性化[23]。同時(shí)，使用靶向Her2藥物進(jìn)行治療時(shí)，多種腫瘤細(xì)胞的Her3表達(dá)上調(diào)，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞對(duì)靶向Her2的藥物產(chǎn)生耐受時(shí)，針對(duì)靶向Her3的治療可以克服藥物耐受性[24]。ZUO等[25]前期構(gòu)建了靶向Her3的CAR-T，該CAR-T可識(shí)別殺傷Her3陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3和BT-474，不能殺傷Her3表達(dá)下調(diào)和Her3陰性靶細(xì)胞；該CAR-T在裸鼠體內(nèi)可以遏制SK-BR-3移植腫瘤的生長(zhǎng)，有效延長(zhǎng)荷瘤裸鼠的生存期，該研究為Her3陽(yáng)性腫瘤治療提供了新思路和新方法。

3 實(shí)體腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)

TME中存在大量的免疫細(xì)胞及免疫抑制分子、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)，它們與腫瘤細(xì)胞共同組成巨大的免疫抑制網(wǎng)絡(luò)[26]。TME中的抑制性免疫細(xì)胞如調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells，MDSC)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAM)等分泌抑制性因子如IL-4、IL-10、IL-33、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)等[27]，這些細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子使TME中的免疫系統(tǒng)處于耐受狀態(tài)，嚴(yán)重抑制CAR-T的抗腫瘤作用。另外，實(shí)體腫瘤細(xì)胞高表達(dá)程序性細(xì)胞死亡受體配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)，通過(guò)程序性細(xì)胞死亡受體-1(programmed cell death 1,PD-1)/PD-L1信號(hào)通路抑制T細(xì)胞的活性，產(chǎn)生免疫逃逸。T細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)分泌γ干擾素(interferon gamma，IFN-γ)，而IFN-γ可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)[28]。因此，CAR-T在發(fā)揮抗腫瘤功能時(shí)不可避免地會(huì)受到PD-1/PD-L1信號(hào)通路的抑制。

CAR-T治療實(shí)體腫瘤時(shí)，如何克服免疫抑制性TME的干擾是面臨和必須解決的問(wèn)題。研究者們進(jìn)行了多種嘗試，如：通過(guò)共表達(dá)顯性失活的TGF-β受體，克服TGF-β信號(hào)通路對(duì)免疫反應(yīng)的抑制作用[29]；通過(guò)共表達(dá)共刺激分子配體CD40L和4-1BBL，減緩CAR-T耗竭從而應(yīng)對(duì)免疫抑制性TME[30]；聯(lián)合誘導(dǎo)性表達(dá)IL-12，通過(guò)激活固有免疫細(xì)胞增強(qiáng)CAR-T殺傷功能[31]；靶向自然殺傷細(xì)胞活化性受體NKG2D以識(shí)別免疫抑制性細(xì)胞表達(dá)的NKG2D配體，降低TME內(nèi)MDSC及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例[32]；通過(guò)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)中和反應(yīng)減少M(fèi)DSC募集，拮抗腫瘤免疫抑制進(jìn)而增強(qiáng)CAR-T抗腫瘤活性[33]；通過(guò)設(shè)計(jì)PD-1-CD28嵌合受體[34]或?qū)L-4胞內(nèi)區(qū)更換為IL-7胞內(nèi)區(qū)[35]，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抑制性信號(hào)轉(zhuǎn)換為激活性信號(hào)。此外，聯(lián)合使用單克隆抗體阻斷免疫檢查點(diǎn)分子PD-1或細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4的抑制作用，能進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-T的抗腫瘤功效[36]。

4 細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)

CAR-T在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)釋放細(xì)胞因子以增強(qiáng)抗腫瘤作用，存在誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴的可能，即細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)。在應(yīng)用CAR-T療法時(shí)，機(jī)體會(huì)釋放IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、IFN-γ等多種細(xì)胞因子，誘發(fā)患者出現(xiàn)高熱、低血壓、頭痛，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸困難、呼吸衰竭、多器官功能衰竭等癥狀，甚至死亡[37]。關(guān)于CRS產(chǎn)生的機(jī)制尚不十分清楚，目前普遍認(rèn)為，CAR-T識(shí)別腫瘤細(xì)胞后會(huì)激活旁觀(guān)者免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞)[38]，導(dǎo)致CRS。旁觀(guān)者免疫細(xì)胞被激活后釋放大量細(xì)胞因子，其中IL-6、IL-10和IFN-γ是核心細(xì)胞因子，IFN-γ 可以導(dǎo)致患者出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、頭痛、頭暈和疲勞。IFN-γ也可以激活其他免疫細(xì)胞，其中最重要的是巨噬細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α和IL-10等。TNF-α可以導(dǎo)致患者出現(xiàn)類(lèi)似感冒樣癥狀。IL-6在CRS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用，在CRS患者和小鼠模型中均可觀(guān)察到IL-6水平持續(xù)升高，高水平的IL-6可以導(dǎo)致患者出現(xiàn)毛細(xì)血管滲漏、補(bǔ)體被激活和彌散性血管內(nèi)凝血[39]。非免疫細(xì)胞中的內(nèi)皮細(xì)胞活化后可引起血清血管生成素-2和血管性血友病因子水平升高[40]，這2種細(xì)胞因子可引起患者出現(xiàn)毛細(xì)血管滲漏、低血壓和凝血功能障礙等，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致患者死亡。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞活化也可以產(chǎn)生IL-6。剖檢1例因CAR-T治療死亡患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的高水平IL-6可能是引起嚴(yán)重CRS的主要原因，CRS導(dǎo)致了患者的死亡[41]。根據(jù)目前的研究報(bào)道，在使用CAR-T治療惡性腫瘤的過(guò)程中，患者出現(xiàn)CRS暫時(shí)無(wú)法避免，但可以采用IL-6受體阻斷劑托珠單抗和糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物進(jìn)行干預(yù)，嚴(yán)重時(shí)可采用血液透析治療[38]。CAR-T治療實(shí)體腫瘤還可能出現(xiàn)其他不良反應(yīng)，如神經(jīng)毒性和溶瘤綜合征等。因此，如何在CAR-T設(shè)計(jì)過(guò)程中提高CAR-T的安全性，最大限度地減弱患者出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴的強(qiáng)度，將是今后的主要研究方向之一。

5 CAR-T細(xì)胞來(lái)源

目前，針對(duì)實(shí)體腫瘤的治療方法主要有手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療和靶向治療4種方式，CAR-T 療法屬于靶向治療的一種。近年來(lái)，化學(xué)治療、放射治療聯(lián)合CAR-T已成為腫瘤治療的新策略。制備CAR-T最理想的細(xì)胞來(lái)源是使用患者自身T細(xì)胞，但利用患者自體T細(xì)胞制備CAR-T的方法尚存在不足。由于患者經(jīng)過(guò)化學(xué)治療或放射治療后，從其體內(nèi)分離的T細(xì)胞往往數(shù)量不足或功能障礙，患者自體T細(xì)胞的分篩及基因編輯CAR-T周期長(zhǎng)，極為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，這些均直接影響CAR-T的治療效果。在全球CAR-T行業(yè)的巨頭公司，研究人員使用健康人T細(xì)胞制備CAR-T解決了這一問(wèn)題。2016年輝瑞公司宣布與Cellectis公司合作進(jìn)軍CAR-T領(lǐng)域，Cellectis公司主要提供健康人的T細(xì)胞。2016年2月，Baxalta公司與Precision Bioscience公司合作開(kāi)發(fā)基于健康供者T細(xì)胞的新型通用型CAR-T用于腫瘤治療。2017年3月，國(guó)際著名免疫學(xué)家ALDERTON教授在《Nature Reviews Cancer》發(fā)表評(píng)論，指出應(yīng)用健康人T細(xì)胞制備通用型CAR-T將會(huì)是CAR-T未來(lái)發(fā)展的方向之一[42]。由于健康供者T細(xì)胞對(duì)于患者而言是同種異體細(xì)胞，如何消除患者對(duì)外源同種異體細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)是需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。2017年，QASIM等[43]用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)將人類(lèi)白細(xì)胞抗原 (human leukocyte antigen，HLA)不相符合的健康者T細(xì)胞的CD52分子和T細(xì)胞抗原受體 (T cell receptor，TCR)基因敲除，進(jìn)而改造成靶向CD19分子的通用型CAR-T，對(duì)2例急性B淋巴細(xì)胞白血病嬰兒進(jìn)行治療，2例患兒雖未治愈，但癥狀得到明顯緩解。REN等[44]通過(guò)CRISPR/Cas9同時(shí)敲除TCR和HLA I類(lèi)分子構(gòu)建了通用型CAR-T，其可以減緩宿主針對(duì)異體細(xì)胞發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)宿主未發(fā)生移植物抗宿主病。上述研究展示了通用型CAR-T對(duì)腫瘤的治療效果，這為今后設(shè)計(jì)其他通用型CAR-T提供了參考依據(jù)。

6 展望

近年來(lái)，CAR-T治療實(shí)體腫瘤的臨床試驗(yàn)項(xiàng)目顯著增加，幾乎呈指數(shù)增長(zhǎng)。30 a時(shí)間內(nèi)，CAR-T免疫療法從概念到可以具體操作的方案，尤其是CAR-T免疫療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中取得的驚人突破，讓人們看到了徹底攻克某些類(lèi)型腫瘤的希望。雖然，CAR-T在實(shí)體腫瘤治療領(lǐng)域的研究進(jìn)展相對(duì)緩慢，治療效果不如血液系統(tǒng)惡性腫瘤理想，但是，相信CAR-T治療實(shí)體腫瘤與其他技術(shù)一樣，還需要經(jīng)歷一個(gè)長(zhǎng)的發(fā)展期才能進(jìn)入到逐漸成熟的階段，CAR-T聯(lián)合其他療法治療實(shí)體腫瘤將會(huì)是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。CAR-T治療實(shí)體腫瘤盡管有困難，但未來(lái)仍值得期待。隨著相應(yīng)研究成果的出現(xiàn)，CAR-T治療實(shí)體腫瘤也將迎來(lái)新曙光。