陳福海，鄭安元，溫思露，李芬，陶澤璋

舌鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of tongue，TSCC)是口腔內(nèi)常見的惡性腫瘤，約占口腔癌的30%[1-2]，也是最常見的頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)之一[3]。據(jù)統(tǒng)計，我國每年新增口腔癌病例4.81萬[4]，嚴重威脅著我國人民的身體健康。傳統(tǒng)的舌鱗狀細胞癌治療方法一般包括手術(shù)切除以及配合術(shù)后放療和化療等，但近30年來舌鱗狀細胞癌患者的總體生存率并沒有得到顯著提高，其5年生存率仍低于60%[5-7]。臨床研究表明，患者死亡的原因主要在于舌鱗狀細胞癌的局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移[8]，因此尋找其機制及關(guān)鍵靶點有助于對患者進行及時的早期治療，對改善患者預后具有非常重要的臨床意義。PI3K是PI3K/Akt/mTOR信號通路的關(guān)鍵節(jié)點及上游分子[9-10]，并且有研究表明，在一系列因素的作用下，PI3K的異常激活可以引起其下游分子的激活[11]，從而促進細胞增殖、抑制細胞凋亡以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和血管生成等效應[12-13]。因此抑制PI3K的活性可有效緩解上述效應，有利于腫瘤的治療[14-16]。KIN-193是PI3Kp110β亞型的選擇性抑制劑，并且已有研究表明其細胞毒性較低，安全性較好[17]。因此，本實驗觀察了人舌鱗狀細胞癌CAL27細胞在不同濃度KIN-193作用下的細胞增殖能力、凋亡程度以及形態(tài)學變化，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞與試劑：人舌鱗狀細胞癌CAL27(中國科學院上海細胞資源中心)；澳洲Gibco胎牛血清(美國Invitrogen公司)；高糖DMEM、PBS、DMSO及0.25 %胰酶Trypsin(杭州吉諾生物公司)；細胞增殖和毒性檢測試劑盒CCK-8 (日本同仁化學研究所)；蛋白提取試劑盒、一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物公司)；Cell-LightTMEdU Apollo?567 In Vitro Imaging Kit(廣州銳博生物公司)；KIN-193(美國MCE，MedChemExpress公司)；目的蛋白抗體(美國Cell signaling tech公司)。(2)儀器設備：二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；倒置顯微鏡(德國徠卡儀器有限公司)；全自動顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

1.2 實驗方法 2018年1—7月于武漢大學人民醫(yī)院中心實驗室進行實驗。人舌鱗狀細胞癌CAL27的培養(yǎng)及藥物濃度： CAL27細胞用含10%胎牛血清 (FBS) 及青霉素+鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基20 μg/ml于37 ℃ 5 %CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，用胰酶消化，分組培養(yǎng)。用DMSO溶解KIN-193配置10 mmol/L的母液，取適量KIN-193母液用完全培養(yǎng)基稀釋為終濃度為0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L的KIN-193溶液加入到對應分組細胞中進行培養(yǎng)。

1.2.1 細胞形態(tài)學觀察： 人舌鱗狀細胞癌CAL27培養(yǎng)及KIN-193溶液共同培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學并攝片記錄。

1.2.2 TUNEL法檢測細胞凋亡： 將處于對數(shù)生長期的CAL27細胞用胰酶消化后，取適量加入含有細胞爬片的24空板內(nèi)。第2天細胞貼壁后，加入不同濃度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，在37 ℃ 于5 %CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h，然后應用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒，在全自動顯微鏡下觀察細胞凋亡并拍照記錄。

1.2.3 細胞存活能力檢測： 將CAL-27細胞懸液濃度調(diào)至2×107個/L，每孔加入100 μl到96空板內(nèi)，在37 ℃的 5 %CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。第2天細胞貼壁后，加入不同濃度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，每組設置3個復孔，分24、48、72 h 3個時間段進行培養(yǎng)，在對應時間取CCK-8 10 μl加入到每孔中，并在37 ℃下孵育2 h，使用酶標儀在450 nm處測定吸光光度值，計算相應藥物濃度細胞存活率。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力： 將CAL-27細胞懸液濃度調(diào)至1×107個/L，然后每孔加入250個細胞到6空板內(nèi)。第2天細胞貼壁后，加入不同濃度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，在37 ℃ 于5 %CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 d，然后PBS洗一遍六孔板，再用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，克隆形成實驗檢測計數(shù)細胞，計算克隆形成率(克隆形成率=細胞克隆形成數(shù)/原始種入孔內(nèi)細胞數(shù))。

1.2.5 細胞增殖能力： 將處于對數(shù)生長期的CAL27細胞用胰酶消化后，將適量的CAL27細胞加入含有細胞爬片的24空板內(nèi)。第2天細胞貼壁后，加入不同濃度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，在37 ℃于 5 %CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h，然后應用Cell-LightTMEdU Apollo?567 In Vitro Imaging Kit，在全自動顯微鏡下觀察細胞增殖能力并拍照記錄。

1.2.6 細胞蛋白濃度： 將處于對數(shù)生長期的CAL27細胞用胰酶消化后傳代，將傳代好的細胞分成4組，第2天細胞貼壁后，分別加入終濃度為0 μmol/L(對照組)、10、20、30 μmol/L 的KIN-193溶液共同培養(yǎng)72 h。收集CAL27細胞，用裂解液裂解收集細胞，離心后取上清，BCA 法測定蛋白濃度，調(diào)平蛋白濃度，加1/4總體積的4×LDS和1/10總體積的DTT，水浴變性蛋白，10 %凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃下孵育過夜，然后孵育二抗。采用Western-Bloting經(jīng)Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描，并分析處理顯影蛋白條帶。

2 結(jié) 果

2.1 CAL27細胞形態(tài)學改變 隨著KIN-193濃度的增加，在倒置顯微鏡下觀察到CAL27細胞的貼壁數(shù)量依次減少，而漂浮死亡的細胞增多，細胞體積變小，細胞由長條形變成圓形，且在細胞周圍出現(xiàn)許多突起，細胞邊界模糊不清，見圖1A(插頁Ⅰ)。

2.2 CAL27細胞凋亡的影響 在0、10、20、30 μmol/L的KIN-193干預CAL27細胞48 h后，與對照組相比，加藥組綠色熒光更強，并且CAL27細胞的凋亡呈濃度依賴性增高 (F=7.428，P=0.000)，見圖1B(插頁Ⅰ)。

2.3 CAL27細胞存活能力 CCK-8實驗結(jié)果表明，隨著KIN-193作用濃度和時間的增加，CAL-27細胞的活力明顯被抑制 (24 h、48 h、72 h 的F值與P值分別為：F=6.682，P=0.001；F=14.428，P=0.000；F=38.549，P=0.000)，見圖2。

2.4 CAL-27細胞的克隆形成能力 實驗結(jié)果表明，KIN-193能夠明顯抑制CAL-27細胞的克隆形成能力，并且隨著藥物濃度增加而克隆形成數(shù)量減少(F=75.141，P=0.000)，見圖3(插頁Ⅰ)。

2.5 CAL27細胞增殖作用 EdU實驗結(jié)果表明，隨著KIN-193作用的濃度增加，CAL-27細胞的增殖明顯被抑制，在KIN-193為30 μmol/L 時，對CAL27細胞的增殖抑制最強(F=6.885，P=0.000)，見圖4(插頁Ⅰ、Ⅱ)。

圖2 不同濃度KIN-193對CAL27細胞存活率的影響

2.6 CAL27細胞蛋白表達 KIN-193干預CAL27細胞48 h后，隨著KIN-193藥物濃度的增加，CAL27細胞的 PI3Kp110β蛋白表達量明顯下降，且藥物作用的濃度越高，蛋白表達量下降的程度越大(F=4.312，P=0.04)，見圖5。

圖5 不同濃度KIN-193干預CAL27細胞72 h后 Western blotting的結(jié)果

3 討 論

目前惡性腫瘤成為一種常見疾病，舌鱗狀細胞癌作為常見的惡性頭頸部腫瘤之一，時刻危害著人類的健康。舌鱗狀細胞癌惡性程度較高，因其具有豐富的血液及淋巴循環(huán)，所以其通常在術(shù)后還會有較高的復發(fā)率并且容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[18]。舌鱗狀細胞癌較難早期診斷，一般發(fā)現(xiàn)時已是晚期，極大地危害著患者的生命。通常治療采取手術(shù)及術(shù)后放化療，但臨床上化療藥物不良反應較大，并且因舌鱗狀細胞癌容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥，一般患者預后極差。

PI3K/Akt/mTOR已被證明在腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19-20]，抑制PI3K的活性可有效緩解上述效應，有利于腫瘤的治療[21-23]。但目前大多PI3K抑制劑因抑制PI3Kp110亞基中的全部亞型(包括p110α、p110β、p110γ、p110δ)而使得其肝腎細胞毒性較大[24-26]，另外不可口服以及性質(zhì)不穩(wěn)定也使得其未能進行更深入的研究，限制了它們在臨床上的使用。PI3K分子一般分為3型，其中I型PI3K研究最多，且與腫瘤的關(guān)系最為密切[27]。I型PI3K由調(diào)節(jié)性亞基p85及催化亞基p110組成，當p85與p110結(jié)合減弱甚至分離時，PI3K中的p110亞基被激活發(fā)揮其生物學活性。因此，針對p110亞基的靶向治療有望成為將來新的治療靶點。目前在頭頸部腫瘤p110亞基的抑制劑中，p110α和p110δ抑制劑研究最多，而關(guān)于p110β及p110γ的抑制劑在頭頸部腫瘤中的研究目前尚未有報道。而KIN-193屬于PI3Kp110β的選擇性抑制劑，可有效抑制PI3Kp110β[28]，通過文獻檢索，目前KIN-193尚未在腫瘤中進行大規(guī)模研究。因此，本文研究具有較強的創(chuàng)新性。另外有研究表明，PI3K信號通路不僅與其他腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而且在舌癌的增殖遷移等過程中也發(fā)揮著重要作用[29-30]。因此，本研究觀察了人舌鱗狀細胞癌CAL27細胞在不同濃度的PI3Kp110β亞基抑制劑KIN-193作用下的細胞增殖能力、凋亡程度以及形態(tài)學方面的變化。

腫瘤的引發(fā)不僅是細胞異常增殖分化的結(jié)果，同時也是細胞凋亡調(diào)控障礙的結(jié)果，當細胞的凋亡受到抑制，且不能恢復，就會導致機體細胞數(shù)量的增加，而引發(fā)腫瘤[31-34]。凋亡的調(diào)控是細胞生理死亡和腫瘤發(fā)生的重要機制，對于各種刺激誘導下細胞凋亡機制的分析有助于深入了解腫瘤細胞的生物學及發(fā)現(xiàn)新的治療對策。CCK-8實驗及克隆形成實驗結(jié)果都表明隨著KIN-193濃度的增加，CAL-27細胞存活率及增殖能力逐漸降低，這表明KIN-193可有效地抑制CAL-27細胞的增殖。進一步的TUNEL染色實驗及細胞形態(tài)學變化結(jié)果也表明KIN-193可促進口腔腫瘤CAL-27細胞的凋亡。此外，本結(jié)果表明，KIN-193對PI3Kp110β的抑制作用隨著KIN-193濃度的增強而增強，且與不同濃度的KIN-193抑制CAL27細胞的增殖和促進其凋亡的趨勢一致，這也提示著在人舌鱗狀細胞癌CAL27細胞的促增殖、抗凋亡的腫瘤特性在一定程度上與PI3K分子的p110β亞型的激活相關(guān)。但KIN-193具體是通過何種細胞凋亡途徑促進細胞凋亡的，其機制有待進一步研究。此外，本研究僅停留在細胞水平，后續(xù)還需進行KIN-193在體內(nèi)的效應研究?？偠灾琄IN-193能夠有效地抑制口腔癌CAL27細胞的增殖，促進其凋亡。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

陳福海：提出研究思路、設計研究方案、實施研究過程、分析試驗數(shù)據(jù)、論文撰寫和論文修改；鄭安元、李芬、溫思露：處理數(shù)據(jù)、論文修改；陶澤璋：課題設計、論文修改和論文審核