畢冉冉，白 睿，劉志強(qiáng)，劉惠亮

利用病毒我們可以高效地將要研究的基因在目標(biāo)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或不表達(dá)。目前，病毒轉(zhuǎn)染已廣泛應(yīng)用于基因治療、疫苗生產(chǎn)以及科學(xué)研究[1，2]。常用的病毒載體有腺病毒[3]、反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。慢病毒載體具有可同時(shí)感染分裂和非分裂細(xì)胞[4，5]、外源基因容量大、目的基因表達(dá)穩(wěn)定[6-8]、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，成為目前轉(zhuǎn)染效率較高、應(yīng)用較廣的病毒載體。

慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞前要先進(jìn)行慢病毒構(gòu)建和包裝、濃縮和純化、滴度測(cè)定等步驟，而在實(shí)驗(yàn)操作中這些步驟都會(huì)影響病毒的轉(zhuǎn)染效率。目前還未有關(guān)于探討慢病毒濃縮和純化影響病毒轉(zhuǎn)染效率的相關(guān)文獻(xiàn)，因此筆者主要從病毒濃縮和純化這個(gè)方面比較超濾管法、超速離心法及病毒濃縮液法這三種方法濃縮慢病毒后的GFP轉(zhuǎn)染效率。

1 材料與方法

1.1 材料 293T細(xì)胞；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液；0.25%胰酶(0.25%胰蛋白酶/1 mmol/L EDTA)；胎牛血清(FBS)(康源生物科技有限公司)；psPAX2菌種;pMD2.G菌種；GFP慢病毒載體菌種；LB液體培養(yǎng)液，質(zhì)粒提取專用試劑盒；EntransterTM-H4000試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 pMD2.G、psPAX2及GFP慢病毒載體質(zhì)粒的提取 準(zhǔn)備3個(gè)玻璃管并向其內(nèi)加入3 ml加有氨芐的LB培養(yǎng)液，然后從-80 ℃拿出pMD2.G、psPAX2及GFP慢病毒載體菌種，用黃色槍頭分別吸取15～20 μl的pMD2.G、psPAX2及GFP慢病毒載體菌種加入到先前加了氨芐的LB培養(yǎng)液中，做好標(biāo)記之后將其放入37 ℃全溫振蕩器中振蕩12～15 h。再準(zhǔn)備3個(gè)200 ml的加有氨芐的LB培養(yǎng)液，分別向其內(nèi)加入1 ml先前振蕩好的pMD2.G、psPAX2及GFP慢病毒載體菌種，之后標(biāo)記好將其放入37 ℃全溫振蕩器中振蕩12～15 h。分別收集pMD2.G、psPAX2及GFP慢病毒載體菌種用質(zhì)粒提取專用試劑盒分別提取這三種質(zhì)粒。

1.2.2 GFP慢病毒的包裝和濃縮純化 要進(jìn)行GFP慢病毒的包裝[9-11]和濃縮純化，需要提前1 d接種293T細(xì)胞于10 cm培養(yǎng)皿中，將pMD2.G、psPAX2及GFP慢病毒載體質(zhì)粒以及EntransterTM-H4000試劑混勻后加入培養(yǎng)皿中并將其置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)液。48 h后收集病毒上清液，之后向培養(yǎng)皿中加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)液，24 h后再次收集病毒上清液。之后將收集的病毒上清液分別用超濾管法、超速離心法及病毒濃縮液法進(jìn)行濃縮純化，并使最后濃縮的體積都是400 μl，然后保存于-80 ℃。

1.2.3 三種濃縮病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后GFP的熒光顯微鏡檢測(cè) 24孔板接種293T細(xì)胞，接種密度為1×104個(gè)/ml,接種13個(gè)孔，其中一個(gè)孔作為空白對(duì)照組用不加病毒的新鮮培養(yǎng)液正常培養(yǎng)，其余每4個(gè)孔分為一組，分別命名為超濾管法、超速離心法以及病毒濃縮液法三組，之后分別向每一組的4個(gè)孔中分別加入2、4、8、16 μl的同種濃縮病毒液及Polybrene,并將其置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，更換新鮮培養(yǎng)液并在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞GFP表達(dá)情況。

1.2.4 三種濃縮病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后GFP的流式檢測(cè) 24孔板接種293T細(xì)胞，接種密度為1×104個(gè)/ml,接種13個(gè)孔。其中一個(gè)孔作為空白對(duì)照組用不加病毒的新鮮培養(yǎng)液正常培養(yǎng)，其余每4個(gè)孔分為一組，分別命名為超濾管法、超速離心法以及病毒濃縮液法三組，之后分別向每一組的4個(gè)孔中各加入2 、4、8、16 μl的同種濃縮病毒液以及Polybrene,并將其置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，用0.25%胰酶(0.25%胰蛋白酶/1 mmol/L EDTA)消化細(xì)胞后用離心管收集各孔的細(xì)胞，離心去上清，PBS重懸細(xì)胞，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各管的GFP表達(dá)率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 GFP的熒光顯微鏡檢測(cè) 若293T細(xì)胞表達(dá)GFP,會(huì)在熒光顯微鏡下看到綠色熒光?？瞻讓?duì)照組熒光顯微鏡下未看到綠色熒光(圖1)，隨著轉(zhuǎn)染量的增加，GFP表達(dá)率增加，超濾管法濃縮病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后GFP的表達(dá)效率最高(圖2)。

圖1 熒光顯微鏡觀察空白對(duì)照組293T細(xì)胞GFP表達(dá)情況(100×)

2.2 GFP的流式檢測(cè) 三種濃縮病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，收集各孔細(xì)胞后用PBS重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP的表達(dá)率(圖3、圖4)，圖3示空白對(duì)照組293T細(xì)胞GFP表達(dá)率為0%，每一組中隨著轉(zhuǎn)染量的增加，GFP表達(dá)率增加；相同體積的病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h顯示超濾管法濃縮病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后GFP的表達(dá)效率最高(表1)。

圖2 熒光顯微鏡觀察三種濃縮病毒組轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后GFP表達(dá)情況(100×)

表1 病毒濃縮液法組、超濾管法組、超速離心管法組不同病毒量GFP表達(dá)率的比較

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)空白對(duì)照組293T細(xì)胞GFP表達(dá)率

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)三種濃縮病毒組轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后GFP表達(dá)率

3 討 論

GFP基因是一種新型的報(bào)告基因[12-15]，通過(guò)病毒載體將GFP基因與目的基因結(jié)合然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞使其表達(dá)，然后通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞GFP表達(dá)情況。近年來(lái)，GFP報(bào)告基因已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞水平研究或活體內(nèi)追蹤[16-20]。病毒載體有腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體。其中慢病毒載體與其他兩種病毒載體相比具有轉(zhuǎn)染效率高(可同時(shí)感染分裂和非分裂細(xì)胞、外源基因容量大、目的基因表達(dá)穩(wěn)定、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。慢病毒轉(zhuǎn)染包括慢病毒載體構(gòu)建和包裝、濃縮和純化、感染靶細(xì)胞。其中慢病毒載體構(gòu)建和包裝、濃縮和純化會(huì)影響病毒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的效率。

至今還未有關(guān)于探討慢病毒濃縮和純化影響病毒轉(zhuǎn)染效率的相關(guān)文獻(xiàn)，因此本文主要從病毒濃縮和純化這個(gè)方面探討比較超濾管法、超速離心法以及病毒濃縮液法這三種方法濃縮慢病毒后的GFP轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)比較三種濃縮病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后GFP表達(dá)情況，不管是熒光顯微鏡觀察還是流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果都顯示：隨著轉(zhuǎn)染量的增加，GFP表達(dá)率增高；相同體積的病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h顯示超濾管法濃縮病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后GFP的表達(dá)效率最高。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究可以看出，不同的病毒濃縮方法對(duì)病毒濃縮和純化的效率不同，進(jìn)而影響著病毒轉(zhuǎn)染的效率。超濾管法、超速離心法以及病毒濃縮液法三種病毒濃縮和純化方法中超濾管法濃縮和純化病毒的效果最好，為以后慢病毒的濃縮和純化提供理論依據(jù)。但是本實(shí)驗(yàn)只是初步得出超濾管法濃縮和純化病毒的效果最好，若要進(jìn)一步明確這一結(jié)論還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，本實(shí)驗(yàn)研究的是慢病毒的濃縮和純化，針對(duì)其他載體病毒的濃縮和純化，超濾管法是否仍是三種病毒濃縮方法中濃縮效果最好的，需要下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。