何雪玲，張應(yīng)花

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室 新鄉(xiāng)市分子神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

孤獨(dú)癥是一種復(fù)雜、普遍的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病，多在3歲前發(fā)病，其病因復(fù)雜，臨床表型和遺傳異質(zhì)性明顯。目前對(duì)孤獨(dú)癥的研究主要借助于動(dòng)物模型和細(xì)胞模型。孤獨(dú)癥動(dòng)物模型容易制作，但干擾因素較多，表型多樣且造模周期長(zhǎng)。孤獨(dú)癥體外細(xì)胞模型種類多樣，比較常用的細(xì)胞系有腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤 SH-SY5Y 細(xì)胞、原代神經(jīng)元、淋巴細(xì)胞系及誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。孤獨(dú)癥細(xì)胞模型的建立能彌補(bǔ)動(dòng)物模型的不足，具有可操作性強(qiáng)、周期短等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)闡明孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)藥物作用新靶點(diǎn)、研發(fā)與篩選新藥以及評(píng)價(jià)新藥療效有重要意義。本文就孤獨(dú)癥細(xì)胞模型的應(yīng)用及其相關(guān)病理機(jī)制研究進(jìn)展加以綜述。

1 PC12細(xì)胞

腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞是1976年Greene和Tisehler從大鼠腎上腺髓質(zhì)瘤中移植出的單克隆細(xì)胞株[1]，其在常規(guī)條件下可作為一種兒茶酚胺樣細(xì)胞，具有增殖細(xì)胞的一些特性。PC12細(xì)胞可在神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)下增殖并分化為交感神經(jīng)樣細(xì)胞，其形態(tài)、生理及生物化學(xué)功能接近神經(jīng)元。PC12細(xì)胞已作為一種研究神經(jīng)發(fā)育的標(biāo)準(zhǔn)體外細(xì)胞模型廣泛應(yīng)用于帕金森病、阿爾茨海默癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

孤獨(dú)癥是神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，其發(fā)病機(jī)制與突觸功能異常有關(guān)[2-3]，神經(jīng)信號(hào)蛋白(neuroligins，NLGNs)通過(guò)與突觸前、后神經(jīng)元聯(lián)系并介導(dǎo)信號(hào)的傳導(dǎo)，參與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成、可塑性及成熟[4]。NLGNs上的R451C基因可參與孤獨(dú)癥的發(fā)病[5]。ULBRICH等[6]利用NLGN3轉(zhuǎn)染PC12 Tet-On細(xì)胞，并使用多西環(huán)素誘導(dǎo)PC12 Tet-On細(xì)胞過(guò)表達(dá)NLGN3，進(jìn)行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，R451C突變可引起NLGN3蛋白在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚集，并導(dǎo)致氧化應(yīng)激異常；且?guī)в型蛔冃蚏451C的PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激標(biāo)志物C/EBP同源蛋白、蛋白78含量高于野生型鼠來(lái)源的PC12細(xì)胞，這一結(jié)果與氧化應(yīng)激參與孤獨(dú)癥的發(fā)病機(jī)制是一致的[7]。孤獨(dú)癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，影響因素多樣，研究顯示，人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome，PTEN)與多巴胺功能障礙和孤獨(dú)癥破壞性行為有關(guān)，PTEN基因缺失有利于多巴胺神經(jīng)元的存活及功能恢復(fù)[8-9]，而多巴胺在調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)、行為、情緒和社會(huì)交往中起重要作用。HE等[10]研究顯示，孤獨(dú)癥模型小鼠酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和多巴胺受體增加，導(dǎo)致磷酸化蛋白激酶B(phosphate protein kinase B，P-PKB)增加，推測(cè)孤獨(dú)癥的發(fā)生與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)信號(hào)通路下游靶基因PTEN突變有關(guān)；利用Tet-On啟動(dòng)子處理PC12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Tet-On PC12細(xì)胞中PTEN表達(dá)量低于野生型PC12細(xì)胞，TH、P-PKB、磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphatase cAMP-response element binding protein，P-CREB)均升高；PI3K抑制劑LY294002及血清饑餓處理后的PC12細(xì)胞中TH、P-PKB、P-CREB表達(dá)降低；提示孤獨(dú)癥發(fā)生過(guò)程中PTEN可通過(guò)抑制PI3K/CREB通路使TH表達(dá)降低，為治療孤獨(dú)癥提供了針對(duì)PTEN-TH-多巴胺通路的靶向藥物。

因PC12細(xì)胞具有較高的同質(zhì)性，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞分化、離子通道、受體、遞質(zhì)分泌的各種研究中，PC12細(xì)胞模型為研究孤獨(dú)癥提供潛在的平臺(tái)。由于PC12細(xì)胞是一種腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多次傳代，其形狀和性狀會(huì)發(fā)生改變，所以，在將PC12細(xì)胞模型應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制的研究時(shí)應(yīng)慎重。

2 SH-SY5Y細(xì)胞

SH-SY5Y 細(xì)胞來(lái)源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株，具有類似神經(jīng)元的形態(tài)和生理、生物化學(xué)特性，增殖迅速，可連續(xù)穩(wěn)定傳代，其神經(jīng)外胚層譜系是適合研究神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)表型和神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞模型[11]，且具有成本低、易于培養(yǎng)分化、再生性和重現(xiàn)性較好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的研究[12]。

近年來(lái)，隨著基因組分析技術(shù)的運(yùn)用，研究者發(fā)現(xiàn)，孤獨(dú)癥患者血漿和腦脊液中存在多種microRNA表達(dá)異常[13]。脆性綜合征為孤獨(dú)癥類型中的一種，包括miR-19b-3p在內(nèi)的多種microRNA能調(diào)控脆性綜合征相關(guān)基因[14]。為研究 miR-19b-3p與脆性綜合征相關(guān)基因的關(guān)系，MA等[14]以SH-SY5Y細(xì)胞為模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染NC mimic的SH-SY5Y細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染 miR-19b-3p mimic的SH-SY5Y 細(xì)胞的靶基因RAB18、USP32表達(dá)上升，而靶基因FXR1、DUSP 表達(dá)下降，提示miR-19b-3p有望成為治療孤獨(dú)癥的新靶點(diǎn)。另有研究顯示，孤獨(dú)癥患者血漿和腦脊液中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平增加，提示TNF-α可能是孤獨(dú)癥的生物標(biāo)志物[15]。KALKAN等[16]利用TNF-α干預(yù)SH-SY5Y細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)水平增加，引起神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元缺失，這一現(xiàn)象與孤獨(dú)癥動(dòng)物模型大腦神經(jīng)元缺失是一致的[2]，提示可以用TNF-α干預(yù)SH-SY5Y細(xì)胞以研究孤獨(dú)癥有關(guān)神經(jīng)元缺失的發(fā)病機(jī)制。

SH-SY5Y細(xì)胞作為神經(jīng)毒性模型可用于直觀研究與疾病有關(guān)的突觸異常及相關(guān)蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便，可操作性及重復(fù)性較好，但也存在一些問(wèn)題：首先，與其他細(xì)胞模型相比，SH-SY5Y細(xì)胞不能應(yīng)用于觀察神經(jīng)發(fā)育過(guò)程[17]；其次，SH-SY5Y細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不斷增殖，數(shù)量不斷增加，很難檢測(cè)神經(jīng)保護(hù)劑或神經(jīng)毒性藥物是否影響細(xì)胞增殖率或細(xì)胞死亡率[18]；最后，與原代神經(jīng)元比較，未分化的SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)神經(jīng)毒素和神經(jīng)保護(hù)劑的敏感性較小[19]。

3 原代神經(jīng)元

原代神經(jīng)元培養(yǎng)離體時(shí)間短，遺傳性狀與體內(nèi)細(xì)胞相似，適用于神經(jīng)元形態(tài)、功能和分化等研究。另外，原代神經(jīng)元比多次傳代的細(xì)胞更接近體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的正常發(fā)育狀態(tài)，且該細(xì)胞具有干擾因素少和結(jié)果易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，因此，原代神經(jīng)元體外培養(yǎng)成為研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用方法。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育早期階段神經(jīng)元增殖、分化、凋亡、遷移以及神經(jīng)元形態(tài)和神經(jīng)突觸的形成與聯(lián)系[20]。研究顯示，丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)孤獨(dú)癥模型大鼠腦區(qū)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路活化，而應(yīng)用該通路的特異性抑制劑舒磷酸干預(yù)后其孤獨(dú)癥樣行為得到改善，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路在孤獨(dú)癥的發(fā)生過(guò)程中起重要作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，原代神經(jīng)元經(jīng)VPA 預(yù)處理后Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子β連環(huán)蛋白、磷酸化糖原合成酶激酶-3表達(dá)均上升，提示原代神經(jīng)元內(nèi)Wnt信號(hào)通路活化[21-22]。此外，孤獨(dú)癥患者體內(nèi)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激異常[7]，導(dǎo)致神經(jīng)元成熟障礙。VPA干預(yù)的原代神經(jīng)元能夠較好地模擬孤獨(dú)癥患者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激異常狀態(tài)，并抑制原代細(xì)胞樹(shù)突和軸突長(zhǎng)度，從而影響神經(jīng)元的發(fā)育成熟[23]。應(yīng)用VPA預(yù)處理的原代神經(jīng)元所建立的孤獨(dú)癥細(xì)胞模型，為進(jìn)一步揭示孤獨(dú)癥患者腦區(qū)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激異常的機(jī)制提供了研究平臺(tái)。粘連蛋白突變可引起孤獨(dú)癥小鼠社會(huì)交互障礙[24]，提示粘連蛋白異常與孤獨(dú)癥發(fā)生有關(guān)聯(lián)[25]。進(jìn)一步利用原代細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，粘連蛋白并不影響突觸的數(shù)量，而是影響突觸的抑制性和興奮性功能[26]，提示粘連蛋白影響突觸功能，進(jìn)而引起社會(huì)交互障礙等孤獨(dú)癥行為異常，可能導(dǎo)致對(duì)孤獨(dú)癥易感性增加。

與體內(nèi)試驗(yàn)相比，原代神經(jīng)元培養(yǎng)具有簡(jiǎn)便快速、條件易控制、藥理靶點(diǎn)與環(huán)節(jié)較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，其不足之處在于不能完全模擬在體環(huán)境，限制了原代神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中的廣泛應(yīng)用。

4 淋巴細(xì)胞系

淋巴細(xì)胞亞群分析是檢測(cè)細(xì)胞免疫和體液免疫功能的重要指標(biāo)，總體反映機(jī)體當(dāng)前的免疫功能、狀態(tài)和水平，并可輔助診斷某些疾病如自身免疫性疾病、免疫缺陷病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，對(duì)研究發(fā)病機(jī)制、觀察療效及預(yù)后有重要意義。孤獨(dú)癥患者存在免疫系統(tǒng)異常[27]。丙酸 (propionic acid，PPA)是短鏈脂肪酸，能激活淋巴細(xì)胞系非典型性免疫，且對(duì)孤獨(dú)癥患者淋巴細(xì)胞系線粒體功能障礙有不同的調(diào)節(jié)作用[28]。FRYE 等[29]將孤獨(dú)癥患者的淋巴細(xì)胞暴露于不同濃度的PPA，發(fā)現(xiàn)1 mmol·L-1的PPA作用24、48 h能顯著改善淋巴細(xì)胞系線粒體功能障礙，且能上調(diào)免疫系統(tǒng)活化相關(guān)的基因，特別是涉及免疫球蛋白產(chǎn)生的基因。PPA還能增加海馬區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫活性及促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞和白細(xì)胞介素-6的活化[30]。ROSE等[31]利用男性孤獨(dú)癥患者淋巴細(xì)胞系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，1 mmol·L-1的丁酸脂(butyrate，BT)能改變與線粒體裂變有關(guān)的磷酸酶及張力蛋白同源物誘導(dǎo)的蛋白激酶1、線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白和生理應(yīng)激有關(guān)的蛋白哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白、解偶聯(lián)蛋白2、缺氧誘導(dǎo)因子-1α，并能改變與認(rèn)知和行為相關(guān)的基因CREB1、CamkinaseⅡ，表明BT在生理應(yīng)激和(或)線粒體功能障礙的情況下可增強(qiáng)線粒體功能，改善疾病狀態(tài)下的能量代謝。BT能治療VPA引起的孤獨(dú)癥行為[31]，并對(duì)孤獨(dú)癥相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控[32]，有望成為治療孤獨(dú)癥的新藥。

淋巴細(xì)胞是細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)的主要研究材料，樣本容易獲取，但孤獨(dú)癥患者較分散，疾病的異質(zhì)性明顯，且淋巴細(xì)胞收集后不易保存，不能傳代培養(yǎng)，常需反復(fù)采集患者的樣品，再次取樣較難，給疾病的深入研究帶來(lái)困難。

5 iPSCs

iPSCs是日本科學(xué)家TAKAHASHI等[33]利用 Oct-4、Sox-2、Klf4、c-Myc等4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子組合轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中，使其重編程而得到的類似于胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞類型。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外利用iPSCs已成功構(gòu)建多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞模型[34]，這些細(xì)胞模型帶有捐贈(zèng)者的基因特征，能夠在體外表現(xiàn)出與體內(nèi)病理特征相似的疾病特點(diǎn)。孤獨(dú)癥患者的外周單核細(xì)胞經(jīng)過(guò)仙臺(tái)病毒載體重編程為iPSCs，提供了較好的孤獨(dú)癥細(xì)胞模型，能更好地應(yīng)用于研究其病理機(jī)制、藥物治療、基因治療等[35]。

孤獨(dú)癥iPSCs細(xì)胞模型主要集中在祖細(xì)胞和神經(jīng)元的表型上[36]。RUSSO等[37]成功地用孤獨(dú)癥患者的乳牙牙髓干細(xì)胞編程將其分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，與正常人的乳牙牙髓干細(xì)胞分化的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞比較，孤獨(dú)癥細(xì)胞模型所表達(dá)的與突觸有關(guān)的標(biāo)志物神經(jīng)突觸素1、突觸后致密蛋白95均減少，而神經(jīng)元的標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白2表達(dá)無(wú)明顯變化。孤獨(dú)癥患者來(lái)源的星形膠質(zhì)細(xì)胞能產(chǎn)生較多的活性氧，體外培養(yǎng)96 h發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外谷氨酸含量增高，這與孤獨(dú)癥患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激異常以及谷氨酸含量增加是一致的[38]。星形膠質(zhì)細(xì)胞異常能誘導(dǎo)孤獨(dú)癥的發(fā)生[39]。有研究將星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞可使神經(jīng)元的突觸長(zhǎng)度變短及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)減少，且星形膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)神經(jīng)元形態(tài)改變和突觸形成，與孤獨(dú)癥患者腦組織中存在星形膠質(zhì)細(xì)胞改變并能影響神經(jīng)元的異常是一致的[40]。

盡管使用iPSCs建立疾病模型具有很好的發(fā)展前景，但探尋更理想的種子細(xì)胞仍然是孤獨(dú)癥干細(xì)胞治療的重要課題。牙髓干細(xì)胞是來(lái)源于神經(jīng)嵴的牙源性干細(xì)胞，相比于其他干細(xì)胞，其具有更加明顯的神經(jīng)分化潛能，而且可自體取材，免疫原性低，在治療孤獨(dú)癥疾病方面更具有優(yōu)勢(shì)。但不足之處是，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病使用iPSCs進(jìn)行體外模擬時(shí)能從分子層面分析疾病相關(guān)蛋白的表達(dá)，但無(wú)法觀察到典型的病理表型；另一方面，制備iPSCs所使用的核心轉(zhuǎn)錄因子之一c-Myc 已經(jīng)被證明是癌基因，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染的方法引入外源基因，基因片段會(huì)隨機(jī)插入細(xì)胞基因組中，可能引發(fā)細(xì)胞癌變，因此，用iPSCs開(kāi)展孤獨(dú)癥相關(guān)研究時(shí)應(yīng)該嚴(yán)格控制其致瘤風(fēng)險(xiǎn)。

6 總結(jié)和展望

由于PC12細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞、原代神經(jīng)元、外周淋巴細(xì)胞系及iPSCs用于孤獨(dú)癥相關(guān)研究時(shí)各有利弊，限制了孤獨(dú)癥體外模型的廣泛應(yīng)用。但隨著外顯子測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研究者利用CRISPR /Cas技術(shù)已成功建立了靈長(zhǎng)類孤獨(dú)癥細(xì)胞模型，其細(xì)胞模型無(wú)論是形態(tài)上還是功能上都較接近人類細(xì)胞，對(duì)孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制的研究將起到重要的推進(jìn)作用[41]。由于道德觀念的約束，孤獨(dú)癥患者的標(biāo)本難以得到，成功建立靈長(zhǎng)類來(lái)源的孤獨(dú)癥細(xì)胞模型，對(duì)闡明孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制及發(fā)現(xiàn)特異性標(biāo)志物、藥物作用靶點(diǎn)、研發(fā)與篩選新藥以及評(píng)價(jià)新藥療效有重要意義。