胡瓊 莫麗亞 李先斌 黃彩芝 劉健龍

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，HI）是引起兒童呼吸道感染的常見病原菌。有研究指出，HI是我國(guó)兒童發(fā)生社區(qū)獲得性肺炎的一種重要病原菌，僅次于肺炎鏈球菌，可引起肺炎、支氣管炎、化膿性腦膜炎、膿毒癥等多種疾病，嚴(yán)重威脅兒童的身體健康[1-2]。由于HI是專性寄生的苛養(yǎng)性細(xì)菌，常伴隨其他細(xì)菌而生長(zhǎng)，給分離培養(yǎng)帶來(lái)困難，基于鑒定條件及耐藥機(jī)制復(fù)雜，HI的分布和耐藥性具有地域性差異。因此，本研究對(duì)湖南省兒童醫(yī)院呼吸道感染患兒痰液標(biāo)本分離出的病原菌進(jìn)行分析，以了解本地區(qū)兒童HI感染及復(fù)合感染情況，持續(xù)監(jiān)測(cè)耐藥性變化。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集本院2018年6月—2019年5月因呼吸道感染住院患兒送檢的合格痰標(biāo)本共計(jì)36 452份。送檢的痰標(biāo)本先行涂片鏡檢，如果白細(xì)胞＞10個(gè)/LP而鱗狀上皮細(xì)胞＜25個(gè)/LP的標(biāo)本則視為合格標(biāo)本。

1.2 培養(yǎng)基及試劑盒 嗜血桿菌分離培養(yǎng)基和哥倫比亞血瓊脂平板均購(gòu)自鄭州人福博賽生物公司；VITEK MS及配套的質(zhì)譜靶板購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；嗜血桿菌專用藥敏板購(gòu)自湖南天地人生物公司；7項(xiàng)呼吸道病毒檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝西生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定 痰標(biāo)本經(jīng)離心鏡檢后，取沉淀分別接種于哥倫比亞血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板（Mac平板）、嗜血桿菌專用巧克力平板,置5% CO2培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取HI或其他病原菌，用質(zhì)譜儀VITEK MS鑒定，并用藥敏板進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；呼吸道病毒用專用試劑盒檢測(cè)；嗜血桿菌專用藥敏板自帶β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株 HI ATCC 49247。

1.5 藥敏試驗(yàn) 用配套稀釋液配成1.0麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的菌液上藥敏板，置于35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將檢測(cè)數(shù)據(jù)錄入WHONET 5.5軟件，對(duì)菌株分布和藥敏結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌檢出情況 36 452份痰標(biāo)本共檢出HI 2 974株，陽(yáng)性率8.16%；其中有552株（18.56%）同時(shí)檢出其他病原菌，分別是肺炎鏈球菌266株（占48.19%）、腸桿菌科菌112株（占20.29%）、金黃色葡萄球菌81株（占14.67%）、非發(fā)酵桿菌59株（占10.69%）、其他菌株34株（占6.16%）。

2.2 病毒檢出情況 在本次檢出2 974株HI的痰標(biāo)本中，有2 682份標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行了病毒檢測(cè)，共計(jì)檢出病毒1 093株（40.75%），分別是合胞病毒499株（占45.65%）、副流感病毒281株（占25.71%）、流感病毒229株（占20.95%）、腺病毒84株（占7.69%）。

2.3 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)2 974株HI中的2 708株HI進(jìn)行了藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果顯示：HI對(duì)第三代頭孢菌素、哌拉西林/他唑巴坦和氟喹諾酮類藥物均表現(xiàn)出良好的體外活性，而對(duì)復(fù)方新諾明、氨芐西林和氨芐西林/舒巴坦的耐藥率較高。見表1。

表1 2 708株HI對(duì)抗菌藥物的藥敏結(jié)果

2.4 HI耐藥機(jī)制情況 藥敏測(cè)試板顯示，2 708株HI中有1 060株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，均對(duì)氨芐西林耐藥；β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性阿莫西林/克拉維酸耐藥（BLPACR）型HI檢出183株；β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥（BLNAR）型HI檢出779株，且對(duì)頭孢呋辛和氨芐西林/舒巴坦耐藥。見表2。

表2 2 708株耐藥機(jī)制不同的HI分布情況

3 討論

3.1 HI是引起兒童呼吸道感染的常見病原菌。有研究表明，HI可以通過(guò)黏附侵入呼吸道上皮細(xì)胞，又通過(guò)外膜蛋白的改變逃脫中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬，從而在呼吸道長(zhǎng)期定植[3-4]并繼發(fā)下呼吸道感染，除此之外還可引起化膿性腦膜炎、蜂窩組織炎、關(guān)節(jié)炎及骨髓炎等原發(fā)或繼發(fā)性感染。本研究結(jié)果顯示，2018年6月—2019年5月本院從呼吸道感染患兒中共檢出HI 2 974株，檢出率8.16%，低于楊曉華等[5]報(bào)道的10.2%。分析其可能的原因是：HI的分布可能存在一定的地域和季節(jié)差異；但最主要的原因還是由于HI屬于苛養(yǎng)性細(xì)菌，生長(zhǎng)需要Ⅴ、Ⅹ因子，在一般巧克力平板上菌落小，不易識(shí)別，加上革蘭陽(yáng)性（G+）球菌的干擾，生長(zhǎng)速度慢，臨床上容易漏檢；而使用加了萬(wàn)古霉素等藥物的巧克力培養(yǎng)基，生長(zhǎng)的嗜血桿菌菌落較大，且能抑制G+球菌的生長(zhǎng)，會(huì)更容易識(shí)別。因此，只有不斷提高檢驗(yàn)水平和檢驗(yàn)技術(shù)，才能提高HI的檢出率。

3.2 本研究顯示，檢出HI的呼吸道感染患兒中，有18.56%的患兒同時(shí)檢出其他細(xì)菌，以肺炎鏈球菌多見。有文獻(xiàn)指出，HI與肺炎鏈球菌存在共生關(guān)系，共同在呼吸道感染致病中發(fā)揮協(xié)同作用[6]。此外，本研究病毒檢測(cè)結(jié)果顯示，2 682份HI標(biāo)本中有1 093份同時(shí)檢出了病毒，檢出率達(dá)40.75%，主要是合胞病毒，其中有6株同時(shí)合并2種呼吸道病毒，1株同時(shí)合并3種呼吸道病毒。可能是因?yàn)楫?dāng)呼吸道感染病毒時(shí)，由于病毒的侵入造成上皮細(xì)胞變性、壞死，使HI的繼發(fā)感染有了可趁之機(jī)，而當(dāng)呼吸道感染HI時(shí)，其炎癥反應(yīng)也利于病毒的侵入。可見，兒童感染HI時(shí)可合并感染多種病原體。國(guó)內(nèi)還有研究表明，患兒細(xì)菌合并病毒感染比單一細(xì)菌感染或單一病毒感染的臨床癥狀更加嚴(yán)重，病程更長(zhǎng)，并發(fā)癥更多[7]。因此，本研究提示，臨床醫(yī)師要提高對(duì)患兒復(fù)合感染發(fā)生率的認(rèn)知，盡量避免患兒臨床治療效果不佳、預(yù)后不良等情況的發(fā)生。

3.3 本研究藥敏結(jié)果顯示，HI對(duì)氨芐西林的耐藥率為 67.91%，比甄楊等[8]報(bào)道的 52%、徐和平等[9]報(bào)道的28.4%及陶云珍等[10]報(bào)道的32.7%都高，而氨芐西林和阿莫西林是治療HI感染最常用的藥物，但由于耐藥率逐年升高，不宜作為臨床經(jīng)驗(yàn)用藥。

3.3.1 HI的耐藥機(jī)制主要是細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶（TEM-1型或ROB-1型），水解氨芐西林使其失活。本研究中有1 060株HI產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，占39.14%，提示本地區(qū)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是導(dǎo)致HI對(duì)氨芐西林耐藥的主要機(jī)制。

3.3.2 本研究還顯示，HI對(duì)氨芐西林耐藥還有另一機(jī)制，即氨基酸位點(diǎn)突變引起青霉素結(jié)合蛋白改變，產(chǎn)生BLNAR型HI。本研究發(fā)現(xiàn)有779株BLNAR型HI，說(shuō)明BLNAR型HI在本地區(qū)是大量存在的，而其耐藥機(jī)制與以往不同，是HI耐藥模式的一種新表現(xiàn)，原因還有待進(jìn)一步研究。

3.3.3 除了存在β-內(nèi)酰胺酶耐藥機(jī)制外，還存在PBPs基因突變的BLPACR型HI，本研究檢出183株此類HI。

3.3.4 此外，謝成彬等[11]發(fā)現(xiàn)，非產(chǎn)酶HI的基因突變對(duì)氨芐西林和第二代頭孢菌素影響較大，而對(duì)第三代頭孢菌素影響較小，對(duì)非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物影響很小。本研究中HI對(duì)環(huán)丙沙星和利福平等的敏感率均為100%，第三代頭孢菌素敏感率也達(dá)98%以上，幾乎不受青霉素結(jié)合蛋白改變的影響。

3.3.5 本研究還表明，抗菌藥物中復(fù)方新諾明的耐藥率僅次于氨芐西林，其耐藥機(jī)制主要是染色體介導(dǎo)的二氫葉酸還原酶過(guò)量產(chǎn)生,導(dǎo)致與甲基芐氧嘧啶的結(jié)合減少所致。

3.3.6 另外，阿奇霉素是新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，對(duì)HI有較強(qiáng)的抗菌活性[12]。但本研究中阿奇霉素耐藥率也有26.00%，這可能與兒童用藥種類有限、臨床將其作為兒童呼吸道感染常用藥物等因素有關(guān)。隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐藥率不斷升高，本研究提示臨床應(yīng)慎重選擇此藥。

綜上所述，HI是兒童呼吸道感染的重要病原菌。肺炎鏈球菌、呼吸道病毒常合并HI造成兒童呼吸道感染，當(dāng)檢出HI時(shí)應(yīng)警惕其他復(fù)合病原菌或呼吸道病毒的感染。HI對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、第三代頭孢菌素、利福平等有高的敏感率，而對(duì)氨芐西林、復(fù)方新諾明、氨芐西林/舒巴坦有較高的耐藥率，尤其是BLNAR型和BLPACR型HI菌株的大量出現(xiàn)，使兒童HI感染控制面臨挑戰(zhàn)。因此應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，延緩耐藥菌株的增長(zhǎng)，從而為臨床提供更全面的診療依據(jù)。