張 倩，金 郁，姚 湧，計永勝，汪學(xué)龍

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，世界人群的隱性感染率約為30%[1]。弓形蟲逸出時破碎宿主細(xì)胞是蟲體損傷機(jī)體的主要原因。課題組在弓形蟲基因組(http://toxodb.org/toxo/)中發(fā)現(xiàn)一個與細(xì)菌三型溶血素(Hemolysin III)同源的弓形蟲三型溶血素(TgHly-Ⅲ)基因。研究[2]顯示蠟樣芽孢桿菌的三型溶血素可以結(jié)合到人紅細(xì)胞表面，形成微孔道，造成紅細(xì)胞裂解。弓形蟲TgHly-Ⅲ基因在蟲體入侵細(xì)胞后33～44 h達(dá)到轉(zhuǎn)錄峰值，與蟲體逸出時間以及另一調(diào)節(jié)物質(zhì)脫落酸的合成峰值時間吻合。但TgHly-Ⅲ在弓形蟲逸出過程的作用尚未明確。該研究通過生物信息學(xué)分析了TgHly-Ⅲ的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化，并對TgHly-Ⅲ進(jìn)行了外源表達(dá)，用TgHly-Ⅲ誘導(dǎo)了弓形蟲的逸出。結(jié)果顯示，外源性TgHly-Ⅲ可以誘導(dǎo)弓形蟲從宿主細(xì)胞提前逸出，此類逸出和宿主細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)。該研究從弓形蟲自身蛋白角度解析了弓形蟲致病作用，為弓形蟲病的防治提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、蟲株與主要試劑蟲體細(xì)胞質(zhì)表達(dá)黃色熒光蛋白的弓形蟲RH株(TgMic-Yfp)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家動物寄生原蟲實驗室索勛教授課題組惠贈，并在液氮保存。實驗所用人包皮成纖維細(xì)胞(human foreskin fibroblast, HFF)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源中心。BAPTA-AM、Z-VAD-FMK、Nec-1購自美國Sigma-Aldrich公司；anti-Bax、anti-JNK、anti-pJNK、anti-actin、anti-p38、anti-p-p38抗體購自上海生工生物工程股份有限公司。蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于南京碧云天生物科技有限公司。

1.2生物信息學(xué)分析和蛋白表達(dá)本研究所用蛋白序列比對網(wǎng)站為歐洲生物信息研究所https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/；蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站為華盛頓大學(xué)Baker實驗室http://robetta.bakerlab.org/。轉(zhuǎn)化有pET28a-TgHly-Ⅲ載體的BL21感受態(tài)以菌液形式保存于本實驗室-80 ℃冰箱。將此菌液接種于含卡那霉素的Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，約12 h，次日用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，分時間段收集菌液，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對蛋白進(jìn)行純化，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行濃度測定。

1.3蟲體逸出實驗弓形蟲TgMic-Yfp速殖子培養(yǎng)于HFF細(xì)胞，36 h后，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入重組TgHly-Ⅲ至終濃度10 μg/ml (以不加蛋白和10 μg/ml BSA作為對照組)，分別孵育0、30和60 min。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)基中的速殖子進(jìn)行計數(shù)，體積為每個處理計數(shù)50 μl培養(yǎng)基。為檢測逸出是否與蟲體鈣離子、運(yùn)動能力有關(guān)，TgHly-Ⅲ孵育前先用BAPTA-AM(5 μmol/L、10 min)、細(xì)胞松弛素-D(Cytochalasin-D，Cyto-D，5 μmol/L、20 min)進(jìn)行預(yù)處理；為檢測逸出是否與宿主細(xì)胞凋亡或程序性壞死通路有關(guān)，感染細(xì)胞用Z-VAD-FMK(10 μmol/L、20 min)或Nec-1(20 μmol/L、20 min)進(jìn)行預(yù)處理[3]；然后用10 μg/mlTgHly-Ⅲ孵育60 min，用流式細(xì)胞儀對逸出蟲體進(jìn)行計數(shù)。

1.4Westernblot實驗弓形蟲TgMic-Yfp速殖子培養(yǎng)于HFF細(xì)胞，36 h后，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入TgHly-Ⅲ蛋白至終濃度10 μg/ml，分別孵育0、30和60 min。收集細(xì)胞總蛋白，用SDS-PAGE電泳分離蛋白(20 μg/孔)，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，按順序孵育抗體，顯色?？贵w稀釋比例按照文獻(xiàn)報道[4]，做相應(yīng)調(diào)整為：Anti-Bax(1 ∶2 000)、anti-JNK(1 ∶1 000)、anti-pJNK(1 ∶1 000)、anti-actin(1 ∶5 000)、anti-p38(1 ∶1 000)、anti-p-p38(1 ∶500)。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，作圖軟件為GraphPad Prism 6.0。組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TgHly-Ⅲ蛋白的生物信息學(xué)分析和表達(dá)克隆得到了TgHly-Ⅲ基因片段，并提交到美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(GenBank: KF651011.1)，對TgHly-Ⅲ蛋白序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，TgHly-Ⅲ屬于溶血素蛋白家族成員，氨基酸序列同諾氏瘧原蟲溶血素蛋白(PkHly)和夏氏瘧原蟲溶血素蛋白(PcHly)、蠟樣芽孢桿菌三型溶血素(SaHly-Ⅲ)存在很大相似性，尤其是80個氨基酸以后的三型溶血素蛋白功能區(qū)域，進(jìn)化上也比較相近。見圖1A。對TgHly-Ⅲ三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測顯示其為跨膜蛋白，可能存在細(xì)胞膜穿孔功能。TgHly-Ⅲ大小約為30 ku，與預(yù)測結(jié)果相近。見圖1B。

2.2外源性TgHly-Ⅲ蛋白誘導(dǎo)蟲體逸出用弓形蟲TgMic-Yfp感染HFF細(xì)胞36 h后，用10 μg/ml的TgHly-Ⅲ孵育細(xì)胞不同時間(0 、30 、60 min)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用流式細(xì)胞儀分析50 μl培養(yǎng)液中蟲體數(shù)目，計算逸出效率。結(jié)果顯示，隨著外源表達(dá)的TgHly-Ⅲ蛋白孵育時間延長，培養(yǎng)基中蟲體數(shù)目升高(F=254.4，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而無蛋白添加組和BSA組蟲體數(shù)目無明顯變化，顯示TgHly-Ⅲ蛋白可以有效誘導(dǎo)蟲體逸出。 用鈣離子螯合劑BAPTA螯合蟲體內(nèi)鈣離子后，TgHly-Ⅲ誘導(dǎo)蟲體逸出比率顯著下降(TgHly-Ⅲ組vsTgHly-Ⅲ+BAPTA組：22 470±4 203vs2 164±666.1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=69.33，P<0.05)。同樣結(jié)果出現(xiàn)在Cyto-D處理組，蟲體逸出比率下降(TgHly-Ⅲ組vsTgHly-Ⅲ+BAPTA組：21 514±3 157vs2 250±871.6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=104.8，P<0.05)。此結(jié)果提示TgHly-Ⅲ誘導(dǎo)蟲體逸出與鈣離子和蟲體運(yùn)動能力有關(guān)。見圖2。

2.3宿主細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)用細(xì)胞死亡抑制劑對TgHly-Ⅲ誘導(dǎo)蟲體逸出進(jìn)行阻斷。結(jié)果顯示：細(xì)胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK能有效抑制TgHly-Ⅲ誘導(dǎo)性蟲體逸出(TgHly-Ⅲ組vsTgHly-Ⅲ+Z-VAD-FMK組：25 455±3 244vs6 218±938.4)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=81.51，P<0.05)。但是，細(xì)胞程序性壞死抑制劑Nec-1對TgHly-Ⅲ誘導(dǎo)性蟲體逸出的阻斷效果不明顯(TgHly-Ⅲ組vsTgHly-Ⅲ+Nec-1組：25 455±3 244vs20 117±4 412)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=81.51，P>0.05)。此外，檢測了TgHly-Ⅲ孵育細(xì)胞后主要凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：促凋亡蛋白Bax隨著TgHly-Ⅲ孵育時間增加表達(dá)量上升。同時JNK蛋白和p38蛋白的磷酸化水平提高。見圖3。

3 討論

弓形蟲對宿主的致病性多是在胞內(nèi)增殖末期逸出時破碎被感染細(xì)胞引發(fā)的。因此，研究蟲體逸出的調(diào)控機(jī)制有助于解析蟲體的毒力及其致病機(jī)制[5]。

早期研究[6]表明，誘導(dǎo)弓形蟲從宿主細(xì)胞逸出的是鈣離子載體A23187。鈣離子載體誘導(dǎo)體逸出賴于蟲體細(xì)胞骨架的重組和蟲體的運(yùn)動能力。用膜通透性鈣離子螯合劑BAPTA-AM處理蟲體感染的細(xì)胞后，鈣離子載體誘導(dǎo)蟲體逸出就不會發(fā)生。誘導(dǎo)弓形蟲逸出的蟲體效應(yīng)蛋白也多與鈣離子相關(guān)，例如弓形蟲穿孔素樣蛋白(TgPLP-1)[5]、弓形蟲肌球蛋白H(TgMyoH)[7]、弓形蟲鈣依賴蛋白激酶1(TgCDPK1)[8]和弓形蟲鈣依賴蛋白激酶3(TgCDPK3)[9]等。本研究建立了用流式細(xì)胞儀檢測弓形蟲逸出的實驗平臺，發(fā)現(xiàn)外源表達(dá)純化的TgHly-Ⅲ蛋白可以有效誘導(dǎo)弓形蟲從宿主細(xì)胞逸出，提示此蛋白在弓形蟲致病過程中的作用。同時，TgHly-Ⅲ蛋白誘導(dǎo)弓形蟲逸出與蟲體內(nèi)鈣離子以及蟲體運(yùn)動能力有關(guān)，提示逸出過程是蟲體主動的。弓形蟲蟲體鈣離子調(diào)節(jié)通路主要有IP3依賴途徑[10]和脫落酸途徑[11]，TgHly-Ⅲ蛋白誘導(dǎo)弓形蟲逸出所依賴的信號通路仍有待于進(jìn)一步研究。TgPLP-1是弓形蟲經(jīng)典的膜穿孔蛋白，在弓形蟲逸出細(xì)胞前釋放，定位于蟲體微線體。本文所研究的TgHly-Ⅲ蛋白生物信息學(xué)分析也合成于蟲體逸出前期，但具體蟲體定位需要進(jìn)一步實驗確定。

此外，死亡受體Fas與其配體的結(jié)合以及穿孔素孵育、一氧化氮[12]、腫瘤壞死因子-α等宿主細(xì)胞免疫因子都能激發(fā)蟲體從感染細(xì)胞中逸出，與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)介導(dǎo)的宿主細(xì)胞鈣離子釋放有關(guān)[13]，并引發(fā)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡分為內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡兩種。本研究顯示，TgHly-Ⅲ蛋白誘導(dǎo)弓形蟲逸出依賴于宿主細(xì)胞凋亡途徑，并且凋亡相關(guān)蛋白JNK和p38的表達(dá)或磷酸化水平提高，與蠟樣芽孢桿菌非溶血性腸毒素誘導(dǎo)非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)凋亡的模式相似[3]。需要說明的是，本研究結(jié)果顯示，TgHly-Ⅲ蛋白誘導(dǎo)弓形蟲逸出依賴于宿主細(xì)胞凋亡途徑的完整以及蟲體的運(yùn)動能力，兩者缺一不可。雖然尚未檢測TgHly-Ⅲ蛋白對宿主細(xì)胞膜完整性的影響，根據(jù)已得實驗結(jié)果推測，外源性TgHly-Ⅲ蛋白孵育可能使宿主細(xì)胞膜產(chǎn)生微孔，進(jìn)而引起細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，促進(jìn)宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡，最后引發(fā)蟲體逸出。阻斷凋亡途徑后，雖說細(xì)胞膜產(chǎn)生微孔，但蟲體并不逸出，提示宿主細(xì)胞凋亡途徑的相關(guān)因子激發(fā)蟲體運(yùn)動逸出，這個銜接因子值得進(jìn)一步研究確定。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討蟲體內(nèi)源性TgHly-Ⅲ在蟲體逸出過程中的作用及其與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用奠定基礎(chǔ)。

圖1 TgHly-Ⅲ蛋白的生物信息學(xué)分析和蛋白表達(dá)

圖2TgHly-Ⅲ蛋白誘導(dǎo)弓形蟲逸出以及與鈣離子、蟲體運(yùn)動能力的關(guān)系檢測
A：檢測系統(tǒng)；B：TgHly-Ⅲ蛋白誘導(dǎo)弓形蟲逸出；與TgHlyⅢ 0 min組比較：*P<0.05；C、D：TgHly-Ⅲ蛋白誘導(dǎo)弓形蟲逸出與蟲體運(yùn)動能力、鈣離子的關(guān)系；與Ctrl組比較：*P<0.05；與TgHlyⅢ組比較：#P<0.05

圖3TgHly-Ⅲ蛋白誘導(dǎo)弓形蟲逸出與細(xì)胞凋亡、程序性壞死的關(guān)系檢

A：TgHly-Ⅲ蛋白誘導(dǎo)弓形蟲逸出與細(xì)胞凋亡相關(guān)；與Ctrl組比較：*P<0.05；與Z-VAD-FMK組比較：#P<0.05；B、C：細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的檢測；與Ctrl組比較：*P<0.05