李雪婷，萬(wàn)麗娟，張群慧，陳明衛(wèi)，夏同佳，許 敏，唐松濤

肥胖與結(jié)腸癌[也稱為結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)]之間的關(guān)系目前已有很多相關(guān)報(bào)道，肥胖患者CRC發(fā)生率較非肥胖人群明顯增高[1]。近年來(lái)有許多關(guān)于脂肪因子(如瘦素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素等)與CRC之間的研究，網(wǎng)膜素(Omentin)是一種可增加胰島素敏感性的脂肪因子，在血循環(huán)中Omentin-1是Omentin的主要表現(xiàn)形式，但目前關(guān)于Omentin與CRC之間的關(guān)系的研究較少。有研究[2]顯示CRC患者中血清Omentin-1水平高于正常對(duì)照人群，而且這種改變與肥胖無(wú)關(guān)，提示CRC患者血清中高水平的Omentin-1與肥胖人群脂肪組織的分泌作用關(guān)系不大。課題組的前期研究[3]表明不同濃度的外源性O(shè)mentin-1分別干預(yù)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞24 h、48 h，Omentin-1可促進(jìn)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、抑制其凋亡，效應(yīng)呈濃度和時(shí)間依賴關(guān)系。 該研究通過體外實(shí)驗(yàn)RNA干擾沉默Omentin-1基因，進(jìn)一步探索Omentin-1基因沉默后SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的變化。

1 材料與方法

1.1材料人SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；siRNA購(gòu)自上海吉碼制藥技術(shù)有限公司；RNAiMAX、TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；MTT、DMSO購(gòu)自德國(guó)Sigma公司； Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海貝博生物公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物科技公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；引物購(gòu)自上海生物工程有限責(zé)任公司；Opti-ME購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2人SW480結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)人SW480結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 ～ 2 d換培養(yǎng)液，細(xì)胞生長(zhǎng)至85%融合時(shí)傳代。細(xì)胞在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前1 d更換成無(wú)抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基。

1.3人SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的Omentin-1基因轉(zhuǎn)染將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞消化后收集細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞均勻鋪在24孔板中，每孔500 μl無(wú)雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，24 h后，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度為60% ～ 80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。FAM-siRNA上游引物序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。設(shè)置FAM-siRNA轉(zhuǎn)染終濃度為10、30、50、80、100 mmol/L 5組，分別取相應(yīng)體積的FAM-siRNA稀釋于25 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，另每組各取1.5 μl轉(zhuǎn)染試劑RNAiMAX稀釋于25 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，分別混勻后室溫靜置5 min，然后將兩種稀釋液混合后室溫靜置10 min，將混合液逐滴加入到24孔板中，輕輕搖晃24孔板使混合液與細(xì)胞充分接觸，培養(yǎng)箱中避光孵育24 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。整個(gè)轉(zhuǎn)染過程避光操作，使用無(wú)酶移液槍頭和離心管。

1.4RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染后Omentin-1基因沉默變化針對(duì)人Omentin-1基因的siRNA(human Omentin-1-siRNA)上游引物序列：5′-GCACUGAGAAUGGUGUUAUTT-3′，下游引物序列：5′-AUAACACCAUUCUCAGUGCTT-3′，陰性對(duì)照序列SiRNA：上游引物序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞消化后收集細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，每孔加入2 ml無(wú)雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染目的基因siRNA)、陰性組(轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列siRNA)、正常對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)、MAX組(只含轉(zhuǎn)染試劑)。按照siRNA轉(zhuǎn)染終濃度50 nmol/L(前一步已驗(yàn)證細(xì)胞在siRNA終濃度為50 nmol/L時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高)轉(zhuǎn)染含有Omentin-1基因的siRNA，溫箱中孵育24 h后，分別收集每組細(xì)胞，按照TRIzol一步法提取RNA，測(cè)定每組RNA濃度和純度，然后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟合成cDNA。human Omentin-1上游引物序列：5′-AGGAAAGTGCAGCTGAGACT-3′，下游引物序列：5′-GGAGACG AAGAACAGGTCCA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度138 bp；GAPDH上游引物序列：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物序列：5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度138 bp；擴(kuò)增體系25 μl，分別為上下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，DEPC水8.5 μl，SYBR Premix 12.5 μl。擴(kuò)增程序：95 ℃、 30 s預(yù)變性，95 ℃、 5 s，60 ℃、 30 s，40個(gè)循環(huán)。讀取每個(gè)反應(yīng)的Ct值，2-ΔΔCt表示基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5增殖實(shí)驗(yàn)將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞消化后收集細(xì)胞，以每孔6×104個(gè)細(xì)胞均勻鋪在96孔板中，每孔加入100 μl無(wú)雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入180 μl不含血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基和20 μl MTT(濃度為5 mg/ml)，避光孵育4 h，去掉上清液，每孔加入150 μl DMSO，立即在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(optical density, OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.6凋亡實(shí)驗(yàn)將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞消化后收集細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，每孔加入2 ml無(wú)雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24 h，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，加入400 μl結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V-FITC，混勻后，4 ℃避光孵育15 min，加入10 μl PI液，混勻后4 ℃避光孵育5 min，立即在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Flowjo V7軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染效率鑒定使用FAM-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后在熒光顯微鏡下觀察，鏡下可見視野內(nèi)帶熒光的細(xì)胞。細(xì)胞在siRNA終濃度為50 nmol/L 時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況 ×40

2.2PCR鑒定基因沉默結(jié)果與正常對(duì)照組比較，陰性組和MAX組Omentin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；分別與正常對(duì)照組、陰性組和MAX組比較，轉(zhuǎn)染組Omentin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.044，P<0.05)。見圖2。

2.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組和MAX組OD值沒有明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；分別與正常對(duì)照組、陰性組、MAX組比較，轉(zhuǎn)染組OD值下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.499，P<0.05)。見圖3。

2.4細(xì)胞凋亡結(jié)果與正常對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組和MAX組凋亡率沒有明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；分別與正常對(duì)照組、陰性組、MAX組比較，轉(zhuǎn)染組凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.366，P<0.05)。見圖4。

圖2 Omentin-1基因mRNA沉默效果鑒定

與正常對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性組比較：△P<0.05；與MAX組比較：#P<0.05

圖3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較：*P<0.05；與陰性組比較：△P<0.05；與MAX組比較：#P<0.05

3 討論

CRC是導(dǎo)致全球癌癥患者死亡的第三大常見的癌癥，研究[4]表明肥胖(特別是腹型肥胖)是CRC發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)因素，研究[5-6]顯示隨著身體質(zhì)量指數(shù)和腰圍的增加，CRC患病的風(fēng)險(xiǎn)也將提高。目前有關(guān)肥胖與CRC的研究[7]表明，肥胖導(dǎo)致CRC風(fēng)險(xiǎn)增加可能與肥胖導(dǎo)致的慢性低度炎癥狀態(tài)，或與體內(nèi)一些激素水平異常有關(guān)，如胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子等。

近年來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到脂肪組織分泌的脂肪因子可能在CRC的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。網(wǎng)膜素是一種內(nèi)臟脂肪表達(dá)的可增加胰島素敏感性的脂肪因子，有兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因：Omentin-1和Omentin-2，在血循環(huán)中，Omentin-1是主要的表現(xiàn)形式。臨床研究[8]表明，肥胖人群中血清網(wǎng)膜素水平及網(wǎng)膜組織網(wǎng)膜素的基因表達(dá)水平均降低，且網(wǎng)膜素表達(dá)水平與身體質(zhì)量指數(shù)及腰圍等肥胖指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。盡管肥胖患者Omentin-1水平明顯降低，但是目前臨床研究未能證實(shí)Omentin-1是肥胖患者發(fā)生CRC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此，在體外實(shí)驗(yàn)中，通過敲除CRC細(xì)胞株Omentin-1基因，從而降低Omentin-1水平，將有助于更清晰地闡明Omentin-1在CRC發(fā)生過程中的作用。

本研究結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞中Omentin-1基因被沉默后，Omentin-1表達(dá)明顯降低，轉(zhuǎn)染組凋亡率明顯上升、增殖率明顯下降，提示Omentin-1促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、抑制其凋亡。Aleksandrova et al[9]的前瞻性群組研究表明，Omentin-1水平與CRC之間有密切的關(guān)系，高水平的Omentin-1更容易發(fā)生CRC，網(wǎng)膜素-1可以作為預(yù)測(cè)CRC風(fēng)險(xiǎn)的新型標(biāo)志物，Szydo et al[10]研究顯示Omentin-1蛋白在CRC中表達(dá)增加及Omentin-1基因在間皮瘤中表達(dá)增加，且Fazeli et al[2]研究也顯示CRC患者Omentin-1水平明顯高于健康對(duì)照者，與本研究結(jié)果一致。

但是，也有研究[11]顯示，無(wú)糖尿病的Ⅲ期CRC患者進(jìn)行手術(shù)和奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶等化學(xué)藥物治療后，Omentin-1水平明顯升高。與此同時(shí)，Kimet al[12]研究表明intelectin-1水平的升高可以作為Ⅳ期癌癥預(yù)后較好的標(biāo)志。Maeda et al[13]通過對(duì)TMEM207(一種不典型的跨膜蛋白)研究表明Omentin-1水平的下調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致進(jìn)展期CRC患者預(yù)后不良。然而這與本課題組及Aleksandrova et al[9]、Fazeli et al[2]的研究結(jié)果相反。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

有研究[13]表明脂肪因子在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖或凋亡效應(yīng)上可能取決于不同癌細(xì)胞類型；Somasundar et al[14]研究顯示瘦素可促進(jìn)乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞的增殖，但促進(jìn)腺癌Mia-PaCa和PANC-1細(xì)胞凋亡；Zhang et al[15]研究結(jié)果顯示Omentin-1可通過調(diào)節(jié)沉默信號(hào)調(diào)控因子(Sirt1)依賴的p53去?；饔茫龠M(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡；因此，Omentin-1對(duì)其他CRC細(xì)胞系(如CaCo-2、HCT116)在增殖凋亡方面可能也會(huì)產(chǎn)生不同的效應(yīng)。關(guān)于Omentin-1對(duì)CRC細(xì)胞的作用有爭(zhēng)議，還有一種解釋是可能與Omentin-1在不同類型致癌過程中體現(xiàn)的“Janus-faced”病理生理學(xué)特性有關(guān)。因此Omentin-1與CRC細(xì)胞以及CRC之間的關(guān)系還需進(jìn)一步的研究。