李燕軍 ，毛 倩，韓洪軍，高立棟，張順棠，丁念念，陳 寧

(1. 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司博士后科研工作站，項(xiàng)城 466200)

隨著石化資源的日益消耗和環(huán)境污染的日益突出，開(kāi)發(fā)以生物資源為基礎(chǔ)的石化經(jīng)濟(jì)的替代路線對(duì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義．利用微生物對(duì)生物質(zhì)原料進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化是生物經(jīng)濟(jì)的核心環(huán)節(jié)．廉價(jià)的木質(zhì)纖維素原料是儲(chǔ)量巨大的生物質(zhì)資源，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成．現(xiàn)行發(fā)酵工業(yè)主要以糧食來(lái)源的淀粉糖為原料，對(duì)糧食安全構(gòu)成一定的威脅，開(kāi)發(fā)以農(nóng)林廢棄物為代表的木質(zhì)纖維素原料作為替代碳源是發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)之一．木糖是自然界中含量?jī)H次于葡萄糖的單糖，木糖基的含量在木質(zhì)纖維素中達(dá) 18%～30%，占總糖類(lèi)的 30%～50%[1]．半纖維素水解液中木糖含量可以達(dá)到可發(fā)酵總糖的 90%以上[2]．因此，木糖發(fā)酵是綜合高效利用木質(zhì)纖維素水解液所必需的．

木糖代謝能夠增加特定前體物的供應(yīng)，有利于微生物發(fā)酵生產(chǎn)芳香族氨基酸、組氨酸和核苷、某些維生素及其衍生物．戊糖磷酸途徑(HMP)是除糖酵解(EMP)外細(xì)胞內(nèi)第二重要糖分解代謝途徑，為細(xì)胞的合成代謝提供多種原料．微生物首先通過(guò)HMP途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)木糖的代謝，木糖進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，經(jīng)木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase，XI)催化形成木酮糖，隨后在木酮糖激酶的作用下形成木酮糖–5–磷酸，進(jìn)入HMP途徑．芳香族氨基酸的合成需要經(jīng)過(guò)莽草酸途徑，以來(lái)源于 HMP途徑的赤蘚糖–4–磷酸和來(lái)源于EMP的磷酸烯醇式丙酮酸作為共同初始底物[3]. 利用木糖除了容易生成赤蘚糖–4–磷酸外，還可以減少PTS系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖過(guò)程對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸的消耗．Li等[4]構(gòu)建的重組菌，以木糖與葡萄糖的混合糖為碳源，莽草酸產(chǎn)量比單獨(dú)利用葡萄糖時(shí)要高．

自然界中絕大多數(shù)微生物以葡萄糖為碳源，不具備五碳糖(如木糖和阿拉伯糖)的代謝途徑．半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，谷氨酸棒桿菌一直是重要的氨基酸和核苷生產(chǎn)菌，目前谷氨酸和賴(lài)氨酸的全球年產(chǎn)量分別高達(dá)250萬(wàn)噸和150萬(wàn)噸左右[5–6]．近年來(lái)，隨著代謝工程和合成生物技術(shù)的發(fā)展，利用谷氨酸棒桿菌工程菌株可以生產(chǎn)越來(lái)越多的產(chǎn)品．然而，谷氨酸棒桿菌不具備完整的木糖代謝途徑，其基因組上只含有木酮糖激酶編碼基因．因此，需要引入異源木糖異構(gòu)酶編碼基因才能實(shí)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌對(duì)木糖的利用．本研究首先克隆了多個(gè)外源木糖異構(gòu)酶，通過(guò)質(zhì)粒的形式在谷氨酸棒桿菌中過(guò)表達(dá)，菌株能夠以木糖為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)．其次，對(duì)最優(yōu)木糖異構(gòu)酶表達(dá)質(zhì)粒上核糖體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行替換，促進(jìn)了菌株對(duì)木糖的利用能力．最后，對(duì)木糖表達(dá)元件進(jìn)行了多拷貝基因組整合，實(shí)現(xiàn)了無(wú)質(zhì)粒木糖代謝工程菌株的構(gòu)建．

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(E.coli)DH5α、大腸桿菌(E.coli)MG1655、谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)ATCC 13032、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)ATCC33913、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)168、表達(dá)質(zhì)粒 pXMJ19(CmR，tac啟動(dòng)子)和自殺型質(zhì)粒pK18mobsacB(KmR)均為本實(shí)驗(yàn)室保藏．

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 5，pH 7.0，121℃滅菌 20min．固體培養(yǎng)基含 20g/L瓊脂．

BHI培養(yǎng)基(g/L)：腦心浸提物 37，山梨醇 91，pH 7.0～7.2，121℃滅菌 20min．固體培養(yǎng)基含20g/L瓊脂．

種子培養(yǎng)基(g/L)：BHI培養(yǎng)基，葡萄糖0.5．

發(fā)酵培養(yǎng)基(CGXⅡ，500mL)：(NH4)2SO45g，尿素 1 g，K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.125g，MOPS 21g，1% CaCl2溶液 500μL，VH溶液(1mgVH溶于1L蒸餾水)100μL，原兒茶酸溶液(3，4-二羥基苯甲酸300mg、10mol/L NaOH 1mL、蒸餾水 9 mL 混合)500μL，微量元素混合液(FeSO4·7H2O 1g，MnSO4·H2O 1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO40.02g，NiCl2·6H2O 0.002g，用鹽酸調(diào) pH 至 1.0，蒸餾水補(bǔ)足 90mL)500μL，木糖 5g，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20min．

1.3 培養(yǎng)方法

搖管培養(yǎng)：從-80℃甘油保菌管吸取20μL菌液接種于 BHI搖管，32℃、200r/min搖床培養(yǎng) 12～16h．

種子培養(yǎng)：將BHI搖管中培養(yǎng)的菌液以1%接種量接入裝有 30mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，32℃、200r/min搖床培養(yǎng)8h．

發(fā)酵培養(yǎng)：待種子瓶 A600＝6～8時(shí)，以 4%接種量接入裝有 50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，32℃、200r/min搖床培養(yǎng)．

1.4 菌株構(gòu)建

根據(jù) GenBank中大腸桿菌 MG1655、枯草芽胞桿菌 168和野油菜黃單胞菌 ATCC33913的木糖異構(gòu)酶編碼基因 xylA序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，以各自基因組 DNA為模板，擴(kuò)增xylA基因片段，回收純化 PCR產(chǎn)物．雙酶切(酶切位點(diǎn)見(jiàn)表 1)將 pXMJ19質(zhì)粒線性化，利用 ClonExpress? Ⅱ One Step Cloning Kit(Vazyme)同源重組的方法分別連接4個(gè)xylA基因片段和線性化質(zhì)粒片段，獲得過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pXMJ19-xylAeco、pXMJ19-xylAbsu、pXMJ19-xylAxcc1和pXMJ19-xylAxcc2．采用類(lèi)似方法構(gòu)建 pXMJ19-SDGDH-xylAeco質(zhì)粒，通過(guò)上游引物引入谷氨酸脫氫酶啟動(dòng)子的Shine-Dalgarno(SD)及周邊序列．通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將這些過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌ATCC13032感受態(tài)細(xì)胞中，得到相應(yīng)菌株．

表1 引物Tab. 1 Primers

以谷氨酸棒桿菌 ATCC13032基因組為模板，分別擴(kuò)增上游、下游同源臂片段；以質(zhì)粒 pXMJ19-SDGDH-xylAeco為模板擴(kuò)增木糖異構(gòu)酶 Ptac-SDGDH-xylAeco片段．PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，通過(guò)重疊PCR反應(yīng)獲得整合片段：上游同源臂＋Ptac＋xylA＋下游同源臂．通過(guò)同源重組方法連接到雙酶切線性化的pK18mobsacB質(zhì)粒上，獲得整合質(zhì)粒 pK18mobsacB-xylAeco．采用電轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒 pK18mobsacB-xylAeco轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌 ATCC13032感受態(tài)細(xì)胞．將菌體涂布在含卡那霉素(10μg/mL)的 BHI平板上，于32℃培養(yǎng) 24～30h．待長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后，挑取單菌落分別對(duì)點(diǎn)含卡那霉素和 15%蔗糖的平板，32℃培養(yǎng)16～20h．挑選表型正確(在卡那霉素平板生長(zhǎng)良好而在蔗糖平板生長(zhǎng)受到明顯抑制)的菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，保存正確發(fā)生第一輪交換的菌株．將單交換菌株接種到含卡那霉素的 BHI搖管中培養(yǎng) 12～16h，再轉(zhuǎn)接蔗糖搖管培養(yǎng)后，稀釋 8～10萬(wàn)倍涂布蔗糖平板．將長(zhǎng)出的單菌落分別對(duì)點(diǎn)蔗糖和卡那霉素平板，32℃培養(yǎng) 12～16h，挑選表型正確(在蔗糖平板生長(zhǎng)良好而在卡那霉素平板生長(zhǎng)受到明顯抑制)的菌落，進(jìn)行菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證，得到基因組整合菌株．

1.5 測(cè)定方法

菌體生物量測(cè)定：發(fā)酵過(guò)程中每隔 4h取樣，利用分光光度計(jì)測(cè)定A600值．

殘?zhí)菧y(cè)定：取 500 μL發(fā)酵液于 1.5 mL離心管中，12000r/min離心 2min，取上清液稀釋一定倍數(shù)后，經(jīng) 0.22μm 膜過(guò)濾．用 SPD-20A 型島津高效液相色譜儀測(cè)定木糖濃度，檢測(cè)條件：色譜柱為 Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)，示差檢測(cè)器，流動(dòng)相 5mmol/L硫酸，流量 0.6mL/min，柱溫30℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同來(lái)源木糖異構(gòu)酶的質(zhì)粒過(guò)表達(dá)

Kawaguchi等[7]最早在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建了木糖代謝途徑，在過(guò)表達(dá)來(lái)源于大腸桿菌的木糖異構(gòu)酶(XI，由基因xylA編碼)后，菌株能夠以木糖為唯一碳源生長(zhǎng)．隨后，研究者們紛紛效仿該方法在谷氨酸棒桿菌中過(guò)表達(dá)大腸桿菌的 XI[8–9]．那么，其他細(xì)菌來(lái)源的 XI也值得研究．比如，野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)在葡萄糖存在的條件下能夠穩(wěn)定地代謝木糖[10]，其基因組上存在雙拷貝 xylA，其中一個(gè)與木酮糖激酶編碼基因 xylB形成基因簇，另一個(gè)獨(dú)立存在，且堿基位點(diǎn)存在一些突變．那么可以設(shè)想，野油菜黃單胞菌是否在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中增加了一個(gè) xylA拷貝，該基因上堿基變異是否有利于編碼活性增強(qiáng)的XI．因此，本文分別克隆了野油菜黃單胞菌的兩個(gè)xylA，同時(shí)克隆了枯草芽胞桿菌的和大腸桿菌的 xylA，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)質(zhì)粒 pXMJ19-xylAxcc1、pXMJ19-xylAxcc2、pXMJ19-xylAbsu和 pXMJ19-xylAeco．將 4個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032中，測(cè)定了菌株在以木糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基CGXII上的生長(zhǎng)曲線(圖1)．

圖1 谷氨酸棒桿菌 ATCC13032質(zhì)粒過(guò)表達(dá)不同來(lái)源xylA的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curve of xylA genes from different bacteria overexpressed in C. glutamicum ATCC13032

由圖1可知，攜帶空質(zhì)粒的菌株在木糖培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，出現(xiàn)A600值的小幅上升是由于接搖瓶培養(yǎng)時(shí)從種子液帶入少量培養(yǎng)基．過(guò)表達(dá)野油菜黃單胞菌 xylA時(shí) A600達(dá)到 1左右，且 xylAxcc1效果略好于xylAxcc2．過(guò)表達(dá)枯草芽胞桿菌xylA時(shí)菌株前10h生長(zhǎng)慢于表達(dá)野油菜黃單胞菌 xylA，然而與后者相比，在 10h之后菌株仍然保持較快的生長(zhǎng)速率，培養(yǎng)結(jié)束時(shí) A600達(dá)到 1.38．過(guò)表達(dá)大腸桿菌 xylA時(shí)菌株生長(zhǎng)速率最快，終A600值也最高，達(dá)到1.41．

由此可見(jiàn)，本研究中不同來(lái)源的 XI在谷氨酸棒桿菌 ATCC13032中均成功表達(dá)，pXMJ19質(zhì)粒上x(chóng)ylA表達(dá)的啟動(dòng)子是來(lái)源于大腸桿菌的 tac強(qiáng)啟動(dòng)子．同樣，Kawaguchi等[7]利用來(lái)源于pTrc99A的trc強(qiáng)啟動(dòng)子也實(shí)現(xiàn)了xylA在谷氨酸棒桿菌R菌株中的表達(dá)．然而，葉菁[11]利用 pEC-XK99E質(zhì)粒(trc啟動(dòng)子)在谷氨酸棒桿菌 ATCC13032中表達(dá) xylA失敗，他認(rèn)為可能的原因是trc啟動(dòng)子在谷氨酸棒桿菌中的活性較低，或者 pEC-XK99E在谷氨酸棒桿菌中的拷貝數(shù)較低．由圖 1也可以看出，不同來(lái)源的 XI對(duì)谷氨酸棒桿菌利用木糖的影響較大，表達(dá)大腸桿菌 XI時(shí)木糖代謝水平最高．目前關(guān)于釀酒酵母利用木糖的報(bào)道較多，研究者們利用進(jìn)化工程篩選到木糖代謝和/或乙醇發(fā)酵提高的菌株，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)進(jìn)化菌株基因組上出現(xiàn)了多個(gè)拷貝的 xylA[12-14]．這些結(jié)果表明XI的活性對(duì)重組菌株利用木糖發(fā)揮至關(guān)重要的作用．從反應(yīng)機(jī)理來(lái)看，XI可逆催化從木糖到木酮糖的異構(gòu)化反應(yīng)，反應(yīng)平衡時(shí)木糖的轉(zhuǎn)化率才達(dá)20%左右[15]．因此，為了增強(qiáng)谷氨酸棒桿菌的木糖利用能力，需要源源不斷地高效表達(dá)XI．

2.2 tac啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)的替換

從圖 1可知，雖然表達(dá)大腸桿菌 XI的谷氨酸棒桿菌利用木糖能力最強(qiáng)，但菌體生物量還較低，需要進(jìn)一步強(qiáng)化 XI的表達(dá)．翻譯起始的效率對(duì)基因表達(dá)水平具有重要影響，原核基因的表達(dá)是通過(guò) mRNA 5′端 SD 序列與核糖體 30S亞基結(jié)合來(lái)起始的．SD序列與起始密碼子的距離及之間的堿基組成對(duì)翻譯效率影響顯著[16]．谷氨酸棒桿菌一些基因缺少SD序列，也有SD序列接近或與起始密碼子ATG重疊，這與大腸桿菌等其他細(xì)菌差別很大[17]．考慮到pXMJ19上tac啟動(dòng)子的SD序列與目的基因起始密碼子之間的距離過(guò)遠(yuǎn)，本文在 xylAeco基因起始密碼子前面添加了內(nèi)源谷氨酸脫氫酶的 SD序列及周邊堿基(圖2)，構(gòu)建了pXMJ19-SDGDH-xylAeco，旨在強(qiáng)化XI的翻譯效率．因?yàn)橐吧凸劝彼岚魲U菌可以分泌高濃度的谷氨酸，其谷氨酸脫氫酶活性較高．?dāng)y帶 pXMJ19-xylAeco和 pXMJ19-SDGDH-xylAeco菌株在木糖基本培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線如圖3所示．

由圖3可知，添加谷氨酸棒桿菌內(nèi)源谷氨酸脫氫酶 SD序列后，菌株利用木糖生長(zhǎng)速率明顯加快，最終 A600達(dá)到 3.87，是對(duì)照組的 2.7倍．SDGDH的添加顯著促進(jìn)了xylAeco的mRNA的翻譯．葉菁[11]利用pEC-XK99E的trc啟動(dòng)子在谷氨酸棒桿菌ATCC13032中表達(dá)xylA失敗后，采用谷氨酸棒桿菌內(nèi)源基因groES的啟動(dòng)子及SD序列實(shí)現(xiàn)了xylA的成功表達(dá)．

圖2 xylAeco表達(dá)的tac啟動(dòng)子序列分析Fig. 2 Promoter sequence analysis of tac driving xylAeco expression

圖3 添加內(nèi)源谷氨酸脫氫酶 SD序列表達(dá) xylAeco對(duì)谷氨酸棒桿菌ATCC13032利用木糖的影響Fig. 3 Effect of SDGDH-added expression of xylAeco on xylose utilization by C. glutamicum ATCC13032

2.3 xylAeco在谷氨酸棒桿菌基因組上多拷貝整合

含質(zhì)粒工程菌株在發(fā)酵過(guò)程中存在一定的問(wèn)題，如質(zhì)粒不穩(wěn)定性和菌體生長(zhǎng)變慢，目前工業(yè)生產(chǎn)菌株的構(gòu)建多采用基因組整合的手段．因此，將上述研究確定的 Ptac-SDGDH-xylAeco表達(dá)元件分別進(jìn)行了 1、2和 3個(gè)拷貝的基因組整合．對(duì) 3株無(wú)質(zhì)粒菌株在木糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行了搖瓶培養(yǎng)，生長(zhǎng)曲線如圖4所示．

圖4 在谷氨酸棒桿菌基因組上分別整合 1、2和 3拷貝xylAeco菌株的生長(zhǎng)曲線Fig. 4 Growth curves of C.glutamicum ATCC13032 with 1，2 or 3 copies of xylAeco integrated in its genome

隨著 xylAeco整合拷貝數(shù)的增加，菌株利用木糖生長(zhǎng)的生物量逐步提高，XI的酶活力與谷氨酸棒桿菌代謝木糖的能力呈正相關(guān)．然而，3拷貝菌株培養(yǎng)結(jié)束時(shí) A600值為 2.93，與質(zhì)粒過(guò)表達(dá) xylAeco菌株相差較大．這說(shuō)明xylAeco基因組整合的拷貝數(shù)還不夠．

2.4 基因組整合和質(zhì)粒表達(dá)xylAeco菌株消耗木糖的對(duì)比

為了更好地對(duì)比 3拷貝基因組整合與質(zhì)粒過(guò)表達(dá) xylAeco對(duì)谷氨酸棒桿菌利用木糖的差異，測(cè)定了兩株菌培養(yǎng)過(guò)程中木糖的消耗(圖 5)．由圖 5可知，與菌體生長(zhǎng)情況相吻合，3拷貝整合菌株木糖消耗速率要低于過(guò)表達(dá)菌株．盡管如此，還是成功構(gòu)建了不含質(zhì)粒的木糖代謝工程菌株，為今后開(kāi)發(fā)利用木糖生產(chǎn)有用的化學(xué)品奠定了基礎(chǔ)．

圖5 xylAeco 3拷貝整合和質(zhì)粒過(guò)表達(dá)菌株利用木糖生長(zhǎng)和耗糖曲線Fig. 5 Curves of bacterial growth and xylose consumption by C.glutamicum ATCC13032 xylAeco×3 and C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-SDGDH-xylAeco

另外，也測(cè)試了工程菌株在葡萄糖和木糖混合碳源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和耗糖情況，結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖存在時(shí)木糖幾乎不被消耗．而單獨(dú)利用木糖時(shí)，由于繞過(guò)了 HMP途徑產(chǎn)還原力的氧化階段，預(yù)期不會(huì)取得良好的發(fā)酵效果[18]．關(guān)于葡萄糖和木糖共利用的代謝特性和實(shí)際應(yīng)用意義，在綜述文章中已經(jīng)進(jìn)行了闡述[19]．目前正致力于通過(guò)基因工程手段構(gòu)建可以同步利用兩種糖的谷氨酸棒桿菌工程菌株．

3 結(jié) 論

在谷氨酸棒桿菌中過(guò)表達(dá)大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和野油菜黃單胞菌來(lái)源的木糖異構(gòu)酶編碼基因xylA，成功構(gòu)建了木糖代謝途徑，其中大腸桿菌來(lái)源木糖異構(gòu)酶的菌株利用木糖生長(zhǎng)能力最強(qiáng)．通過(guò)在pXMJ19質(zhì)粒tac啟動(dòng)子上添加谷氨酸棒桿菌內(nèi)源谷氨酸脫氫酶的SD序列及周邊堿基，提高木糖異構(gòu)酶的翻譯效率，菌株利用木糖的生物量提高到出發(fā)菌的2.7倍．同時(shí)通過(guò)多拷貝基因組整合x(chóng)ylA構(gòu)建了無(wú)質(zhì)粒木糖代謝菌株，但其木糖消耗和菌體生長(zhǎng)能力低于質(zhì)粒過(guò)表達(dá)菌株．由于木糖異構(gòu)酶活性的高低是決定木糖代謝水平的關(guān)鍵因素，今后還需要優(yōu)化 xylA表達(dá)的啟動(dòng)子及SD序列，同時(shí)利用新的基因組編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)更多拷貝數(shù)的基因整合，構(gòu)建更加高效的谷氨酸棒桿菌木糖代謝工程菌株．