陳現(xiàn)，何書貴，連若純，林蓉，何來賓，曾勇

(深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent miscarriage，RM)是妊娠期常見的一種并發(fā)癥，也是婦產(chǎn)科中較難處理的疾病，是指在同一性伴侶的情況下連續(xù)發(fā)生2次及2次以上的自然流產(chǎn)，在育齡女性中發(fā)病率為1%～3%[1]。RM的病因主要包括遺傳、內(nèi)分泌和解剖結(jié)構(gòu)異常、感染等因素，另外還有約40%～50%的RM患者病因不明確。目前，人們普遍認(rèn)為抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome，APS)是RM的重要病因之一[2]。APS的發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為主要與血小板活化以及內(nèi)皮細(xì)胞受損等有關(guān)[3]。因此，目前臨床上對患有APS的RM患者的治療主要關(guān)注于如何預(yù)防血栓的形成，然而，抗凝治療只對部分患者有效[3-4]。而早期的研究表明APS患者炎性反應(yīng)異常[5-6]，但是其具體機(jī)制尚不清楚。近年來隨著對自身免疫性疾病的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cells，Breg)是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的B淋巴細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病中起重要的免疫調(diào)節(jié)作用，Breg細(xì)胞的缺失可加重自身免疫反應(yīng)[7-8]。而APS作為一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，同時又可繼發(fā)于SLE或者其它自身免疫性疾病[3]。因此，本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測RM合并APS患者外周血Breg細(xì)胞比例以及表達(dá)IFN-γ和TNF-α的輔助性T細(xì)胞(T helper cells，Th)的比例，探討RM合并APS患者外周血Breg細(xì)胞參與調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，為患有APS的RM患者的治療提供新思路。

資料與方法

一、研究對象

選取2017年1月至2018年3月首次來本院治療的18例RM合并APS患者(APS/RM組)和37例非APS的RM患者(Non-APS/RM組)為研究對象，所有患者均經(jīng)過詳細(xì)詢問病史、染色體核型分析、全身及婦科檢查、宮腔感染和宮腔鏡以及內(nèi)分泌等系統(tǒng)性檢查。同時選取在本中心工作的具有至少1次以上正常妊娠史的女性，共11例為對照組。

APS/RM患者的入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合RM的定義：是指在同一性伴侶的情況下連續(xù)發(fā)生2次及2次以上的自然流產(chǎn)；(2)實驗室標(biāo)準(zhǔn)：至少間隔12周的2次或2次以上發(fā)現(xiàn)血清中存在中等或者高滴度的IgG型和/或IgM型抗心磷脂抗體或抗β2糖蛋白I抗體；(3)夫婦雙方染色體正常；(4)女方生殖解剖結(jié)構(gòu)正常、內(nèi)分泌正常、無其它自身免疫性疾病。

Non-APS/RM患者的入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合RM的定義：是指在同一性伴侶的情況下連續(xù)發(fā)生2次及2次以上的自然流產(chǎn)；(2)夫婦雙方染色體正常；(3)女方生殖解剖結(jié)構(gòu)正常、內(nèi)分泌正常；(4)無自身免疫性疾病、抗磷脂抗體陰性、無高凝傾向。

對照組的入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫婦雙方染色體正常；(2)女方生殖解剖結(jié)構(gòu)正常、內(nèi)分泌正常、無自身免疫性疾病，月經(jīng)規(guī)律；(3)經(jīng)自然受孕且有正常生育史者。

所有研究對象均在月經(jīng)周期的黃體中期首次抽取外周血，并于當(dāng)天分別檢測Breg細(xì)胞比例，以及表達(dá)IFN-γ和TNF-α的Th細(xì)胞比例。本研究入選患者均簽署了知情同意書，實驗流程獲得醫(yī)院學(xué)術(shù)與倫理學(xué)委員會許可。

二、實驗方法

1.流式細(xì)胞術(shù)檢測CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞的數(shù)量：將100 μl 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血加入到流式管中；然后加入CD19-APC (BD，美國)、CD24-PE (BD，美國)、CD38-PE-Cy7 (BD，美國)，振蕩混勻，避光、室溫孵育 15 min；加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，避光孵育10 min；進(jìn)行1 300 r/min離心6 min，去上清；加入含有5%血清的PBS 2 ml充分混勻，再進(jìn)行1 300 r/min離心6 min，去上清；加入200 μl PBS 進(jìn)行細(xì)胞重懸；利用DxFLEX流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，美國)進(jìn)行檢測，并用CytExpert 1.1軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2.流式細(xì)胞術(shù)檢測表達(dá)IFN-γ和TNF-α的Th細(xì)胞的比例：將 100 μl EDTA抗凝全血加入到流式管中；然后加入CD3-PerCP (BD，美國)、CD8-APC-Cy7 (BD，美國)，振蕩混勻，避光、室溫孵育15 min；加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，避光孵育10 min；1 300 r/min離心6 min，去上清；加入含有5%血清的PBS 2 ml充分混勻，1 300 r/min離心6 min，去上清；加入500 μl Perm2進(jìn)行破膜10 min；加入含有5%血清的PBS 2 ml充分混勻，1 300 r/min離心6 min，去上清；加入IFN-γ-FITC (BD，美國)和TNF-α-APC (BD，美國)，避光、室溫孵育15 min，加入PBS 2 ml充分混勻，1 300 r/min離心6 min去上清；加入200 μl PBS進(jìn)行細(xì)胞重懸；利用FACSCanto II流式細(xì)胞儀(BD，美國)進(jìn)行檢測，并用 FACSDiva軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

3.性激素測定：月經(jīng)第2～3天收集患者外周血，化學(xué)發(fā)光法檢測血清FSH、E2、P及LH水平(Cobas E601，Roche，瑞士)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組研究對象基本資料比較

與對照組相比，APS/RM組和Non-APS/RM組的年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、E2、LH、FSH、泌乳素(RPL)和孕酮(P)的表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組基線資料比較

二、外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞在APS/RM患者中的變化情況

在黃體中期，收集對照組11例、APS/RM組18例及Non-APS/RM組37例患者的外周血，分析三組中外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞的比例。與對照組比較，CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞比例在APS/RM組[(3.42±1.31)% vs.(7.16±1.28%)]和Non-APS/RM組[(4.79±1.10)% vs. (7.16±1.28%)]顯著降低(P<0.01)。此外，與Non-APS/RM組相比，APS/RM組外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞比例顯著降低(P<0.01)(圖1)。

三、外周血表達(dá)IFN-γ或TNF-α的Th細(xì)胞在APS/RM患者中的變化情況

外周血表達(dá)IFN-γ的Th細(xì)胞比例在APS/RM組[(29.20±8.01)% vs.(20.60±2.63)%，P<0.01]和Non-APS/RM組[(25.00±6.06)% vs. (20.60±2.63%)]中均顯著高于對照組(P<0.01)，且APS/RM組中表達(dá)IFN-γ的Th細(xì)胞比例顯著高于Non-APS/RM組的比例(P<0.05)(圖2B)。同樣地，表達(dá)TNF-α的Th細(xì)胞比例在APS/RM組[(46.30±7.36)% vs. (29.70±3.94)%，P<0.01]和Non-APS/RM組[(39.70±9.35)% vs. (29.70±3.94)%，P<0.01]中顯著高于對照組；與Non-APS/RM組相比，APS/RM組中表達(dá)TNF-α的Th細(xì)胞比例也顯著增加(P<0.05)(圖2C)。

A：細(xì)胞比例的流式散點代表圖；B：細(xì)胞比例的統(tǒng)計圖；相互比較，**P<0.01圖1 APS/RM患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞的比例

A：表達(dá)IFN-γ或TNF-α的Th細(xì)胞比例的流式散點代表圖；B：表達(dá)IFN-γ的Th細(xì)胞比例統(tǒng)計圖；C：表達(dá)TNF-α的Th細(xì)胞比例統(tǒng)計圖；相互比較，**P<0.01，*P<0.05圖2 APS/RM患者外周血表達(dá)IFN-γ或TNF-α的Th細(xì)胞的比例

四、外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞比例與表達(dá)IFN-γ和TNF-α的Th細(xì)胞比例之間的相關(guān)性分析

進(jìn)一步分析CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞與表達(dá)IFN-γ和TNF-α的Th細(xì)胞比例的相關(guān)性。在對照組中CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞比例與表達(dá)IFN-γ (r2=0.38)和TNF-α (r2=0.49)的Th細(xì)胞比例均呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，而在APS/RM組和Non-APS/RM組中無顯著相關(guān)性(P>0.05)(圖3)。

圖3 外周血CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞比例與表達(dá)IFN-γ和TNF-α的Th細(xì)胞比例的相關(guān)性

討 論

成功的妊娠依賴于母體內(nèi)由眾多免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的精密的免疫調(diào)控，使得母體對胎兒產(chǎn)生免疫耐受，維持妊娠，一旦這些調(diào)控失衡就可能導(dǎo)致流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局[9]。由于B細(xì)胞可以產(chǎn)生自身抗體，一直以來多被認(rèn)為在自身免疫性疾病中發(fā)揮著正向免疫調(diào)節(jié)功能。過去二十年間研究人員也發(fā)現(xiàn)了B細(xì)胞所具備的其它免疫學(xué)功能，包括抗原提呈及依賴于分泌IL-10發(fā)揮免疫抑制作用等[10]。Breg細(xì)胞是一群可以降低炎癥誘導(dǎo)免疫耐受的B細(xì)胞新亞群，主要通過以下兩種途徑來發(fā)揮負(fù)性調(diào)控：一方面，主要通過分泌細(xì)胞因子的方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，其中以IL-10為主導(dǎo)作用，可直接作用于初始CD4+T細(xì)胞，通過抑制Th1細(xì)胞亞群分泌IFN-γ、TNF-α和IL-12，影響Th細(xì)胞的分化與成熟；另一方面，Breg細(xì)胞可通過表面分子B7、CD40與T細(xì)胞表面的CD28、CD40L分子相互作用來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[11]。研究發(fā)現(xiàn)，正常妊娠女性外周血中Breg細(xì)胞的比例顯著高于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性組，而且在正常妊娠女性組中它們可以抑制母體T細(xì)胞的活化及炎性因子TNF-α的分泌[12]。本研究數(shù)據(jù)顯示在Non-APS/RM患者外周血中CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞比例顯著低于對照組，且IFN-γ和TNF-α的表達(dá)水平比對照婦女組均顯著增加。這些結(jié)果均表明Breg細(xì)胞在成功妊娠過程中對免疫應(yīng)答和免疫耐受的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵的作用。

眾所周知，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是婦產(chǎn)科常見的疾病，發(fā)病原因可能與遺傳、內(nèi)分泌、子宮解剖結(jié)構(gòu)、感染和免疫等因素異常有關(guān)，其中有很大一部分是與自身免疫異常有關(guān)[13]。APS作為一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，以動靜脈血栓形成、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和血小板減少等為臨床表現(xiàn)，以體內(nèi)產(chǎn)生大量抗磷脂抗體為特征。APS發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，確切的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，對該病的研究主要集中在自身抗體介導(dǎo)的血栓形成方面，主要包括蛋白C軸抑制、凝血酶生成增多、補體失衡、內(nèi)皮細(xì)胞激活、血小板激活等[3]。近年來，動物模型的證據(jù)表明抗磷脂抗體會導(dǎo)致蛻膜和全身性的TNF-α水平迅速增加[5]。且早期對人類的研究發(fā)現(xiàn)，抗磷脂抗體陽性的RM女性TNF-α啟動子基因水平顯著升高[6]。我們的數(shù)據(jù)也表明在APS/RM組中，IFN-γ和TNF-α的表達(dá)水平顯著高于對照組和Non-APS/RM組。這些結(jié)果均提示APS導(dǎo)致RM可能與免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)，但是其具體機(jī)制目前尚不清楚。

近年來，隨著對炎癥免疫相關(guān)疾病病理機(jī)制認(rèn)識的不斷深入，部分小鼠模型試驗證實Breg細(xì)胞對疾病病情控制和治療有著至關(guān)重要的作用。在人類許多自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和多發(fā)性硬化病(multiple sclerosis，MS) 中均發(fā)現(xiàn)Breg細(xì)胞的數(shù)量或功能的缺乏或丟失均可加重自身免疫反應(yīng)[7-8]。在人類MS中發(fā)現(xiàn)分泌IL-10的Breg細(xì)胞數(shù)量減少，但經(jīng)過治療后細(xì)胞數(shù)逐漸恢復(fù)正常[14]。來自MS患者外周血的Breg細(xì)胞可以抑制T細(xì)胞的增殖和IFN-γ的產(chǎn)生，但對Breg細(xì)胞采用RNA沉默IL-10后，這種抑制功能喪失[15]。另外，在SLE患者中發(fā)現(xiàn)其外周血中CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞雖然數(shù)量上并沒有減少，但在anti-CD40 mAb及CpG的刺激下沒有產(chǎn)生IL-10，也不能抑制Th1細(xì)胞的反應(yīng)[7]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與對照組和Non-APS/RM組比較，APS/RM患者組中CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞比例顯著降低，同時伴隨著IFN-γ和TNF-α的表達(dá)水平的升高。而且，相關(guān)性分析顯示，在對照組中，IFN-γ和TNF-α的表達(dá)水平隨著CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞比例的升高而降低，呈顯著負(fù)相關(guān)性；而在APS/RM組和Non-APS/RM組中無顯著負(fù)相關(guān)性。由此可見，在正常妊娠過程中，Breg細(xì)胞數(shù)量的平衡對免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)控有著重要的作用，而在APS/RM組和Non-APS/RM組中，Breg細(xì)胞數(shù)量可能都發(fā)揮了一定的調(diào)控作用，特別是在APS/RM組，Breg細(xì)胞數(shù)量過低而導(dǎo)致了IFN-γ和TNF-α的表達(dá)水平的顯著升高。這些結(jié)果提示，APS/RM患者中CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞數(shù)量失衡可能在APS介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致流產(chǎn)的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這一發(fā)現(xiàn)打破了人們以往對于APS引起RM的病理機(jī)制的認(rèn)識，有助于對RM合并APS患者病情演變及預(yù)后的判斷提供新的評判指標(biāo)。因此，深入研究Breg細(xì)胞參與APS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，對于探索一種有效的RM合并APS的治療方法具有非常重要的科學(xué)意義。