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煙草KNOX基因家族的結(jié)構(gòu)與表達(dá)模式分析

2019-02-23 07:15劉向真王根發(fā)金立鋒李澤鋒王宇博楊永鋒
煙草科技 2019年2期
關(guān)鍵詞:內(nèi)含子同源外顯子

劉向真,王根發(fā),金立鋒,張 林,魏 攀,王 晨,李澤鋒,王宇博,王 燃,楊永鋒,王 中*

1.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,鄭州經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)第三大街9號(hào) 450000

2.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院,鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院,鄭州市金水區(qū)農(nóng)業(yè)路63號(hào) 450002

4.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道100號(hào) 450001

植物 KNOX(KNOTTED1-like homeobox)基因?qū)儆谕串愋秃校℉omeobox)基因家族,該家族成員編碼一類具有同源異型盒結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,廣泛參與調(diào)控植物體的形態(tài)建成、模式形成等生理活動(dòng)[1-2]。典型的同源異型盒結(jié)構(gòu)域包含由60個(gè)氨基酸殘基組成的3個(gè)螺旋區(qū),其中前兩個(gè)螺旋區(qū)結(jié)合形成環(huán)(Loop)結(jié)構(gòu),第2和第3個(gè)螺旋區(qū)形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)[3]。但也存在一些非典型的同源異型盒結(jié)構(gòu)域,由63個(gè)氨基酸組成非典型的DNA結(jié)合域,在其第1個(gè)與第2個(gè)螺旋之間存在3個(gè)額外的氨基酸(P-Y-P),因此該類型基因也被稱為TABLE(Three Amino-acid Loop Extension)基因家族[4-5]。在植物中,TABLE基因主要包括KNOX和BELL(BEL1-like homeodomain)兩大類。KNOX基因幾乎在所有的植物中均有分布[1],第1個(gè)植物KNOX基因是在玉米(Zea mays)中發(fā)現(xiàn)的Knotted1(Kn1)基因[6],隨后陸續(xù)從多種植物中克隆出了KNOX基因,并且發(fā)現(xiàn)該基因家族成員的數(shù)量隨著多細(xì)胞二倍體(Multicellular diploid)植物的進(jìn)化而逐漸增加[1,7-10]。單細(xì)胞綠藻和紅藻植物只含有1個(gè)KNOX基因,而在陸生植物中KNOX蛋白一般是由多個(gè)成員的基因家族編碼[11]。根據(jù)結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系,可以將這些成員分為兩組(ClassⅠ和Ⅱ),隨后又發(fā)現(xiàn)了雙子葉植物特有的第3個(gè)組(Class Ⅲ)[12-13]。在單細(xì)胞綠藻(Chlamydomonas reinhardtii)中,KNOX蛋白的主要功能是調(diào)控配子體的性別,以及受精卵的發(fā)育[14-15]。在苔蘚植物(Physcomitrella patens)中,盡管兩組KNOX基因主要在孢子體中表達(dá),但其編碼的KNOX蛋白功能發(fā)生了明顯分化。ClassⅠKNOX蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖[16],而ClassⅡKNOX蛋白抑制配子體的發(fā)育[17]。被子植物中ClassⅠ在頂端分生組織(Shoot apical meristem,SAM)的形成和保持過程中發(fā)揮著重要作用[18-19],此外還參與了諸如復(fù)合葉種葉剝離、節(jié)間伸長(zhǎng)、花序形態(tài)結(jié)構(gòu)建成、寄生植物與宿主間的維管連接等生理過程[20-23]。ClassⅡKNOX基因在被子植物的根、莖、葉和花中有表達(dá),該組基因主要參與調(diào)控了植物器官的分化[24],同時(shí)能夠抑制花序莖中維管束纖維次生壁的合成[25-26]。

除了上述的功能分化外,ClassⅠ和ClassⅡKNOX蛋白還表現(xiàn)出功能上的拮抗作用。ClassⅠKNOX基因主要在分生組織表達(dá),但當(dāng)其在葉片組織異位表達(dá)時(shí),植株表現(xiàn)出ClassⅡKNOX基因功能缺失的表型;相反ClassⅡKNOX基因主要在發(fā)育的葉片中表達(dá),當(dāng)其在SAM人為表達(dá)時(shí),會(huì)產(chǎn)生stm(ClassⅠKNOX)功能缺失的表型[24]。KNOX蛋白還參與調(diào)控了多種物質(zhì)的合成代謝,包括赤霉 素(Gibberellicacid,GA)、細(xì) 胞 分 裂 素(Cytokinin,CK)、木質(zhì)素(Lignin)等[25,27]。研究表明ClassⅠKNOX蛋白能夠抑制活性GA的合成,同時(shí)促進(jìn)CK的積累。如煙草NTH15(Nicotiana tabacum homeobox 15)通過直接抑制GA20ox(GA 20-oxidase gene)基因的表達(dá),進(jìn)而抑制赤霉素的合成[28]。玉米 KNOTTED1(KN1)則能夠直接誘導(dǎo)ga2ox1基因的表達(dá),后者編碼的酶能將活性赤霉素轉(zhuǎn)化為非活性赤霉素[29],同時(shí)玉米KNOX蛋白還能抑制木質(zhì)素的合成[30]。在擬南芥和水稻中則發(fā)現(xiàn)KNOX蛋白能夠促進(jìn)CK合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[31-32]。

煙草是一種重要的模式植物,因此煙草基因組學(xué)研究具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。目前,煙草中克隆到的KNOX基因有兩個(gè),除NTH15基因外還發(fā)現(xiàn)NtKNATM1基因在腋芽和頂芽中高量表達(dá)[33]。利用煙草基因組數(shù)據(jù)庫,鑒定煙草KNOX家族所有成員,通過序列分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析以及基因表達(dá)模式分析,旨在為揭示煙草KNOX基因在植物形態(tài)建成、激素信號(hào)、物質(zhì)合成代謝過程中的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器、試劑

利用普通煙草品種紅花大金元(Nicotiana tabacum L.)、林煙草(Nicotiana sylvestris)和絨毛狀煙草(Nicotiana tomentosiformis)為試驗(yàn)材料。2017年3月播種,煙苗長(zhǎng)出4片真葉時(shí)移栽入獨(dú)立的盆缽中置于國(guó)家煙草基因研究中心溫室內(nèi)。生長(zhǎng)條件設(shè)定為28℃光照16 h,23℃黑暗8 h。紅花大金元煙苗正常生長(zhǎng)至盛花期,分別采集花、花蕾、頂芽、葉、莖和根等組織樣品,液氮速凍后放入-80℃冰箱備用。分別采集苗期、旺長(zhǎng)期和成熟期的林煙草和絨毛狀煙草的根、莖樣品,液氮速凍后立即放入-80℃冰箱中保存,備用。

植物多酚RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒以及凝膠回收試劑盒均購自北京艾德萊生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康潤(rùn)誠業(yè)生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限責(zé)任公司;TransTaq?高保真Taq酶試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?,引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。核酸提取、濃度測(cè)定和基因表達(dá)水平檢測(cè)分別采用混合型碾磨儀MM400(德國(guó)Retsch公司)、超 微 量 分 光 光 度 計(jì)Nanodrop 2000(美國(guó)Thermo公司)和熒光定量PCR儀C1000TMThermal Cycler(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成

利用植物多酚RNA提取試劑盒,嚴(yán)格按照操作說明書提取植物材料的總RNA。提取過程中,用RNase-free DNase I去除基因組DNA的污染。提取完成后,分別用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000檢測(cè)RNA樣品的質(zhì)量和濃度。cDNA第一鏈的合成按照Gene Star M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行,轉(zhuǎn)錄完成后再次用Nanodrop 2000檢測(cè)cDNA樣品的濃度,并將其稀釋至40 ng/μL,保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

以Knotted-1-like為關(guān)鍵詞檢索中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫V4.0,獲得普通煙草、林煙草和絨毛狀煙草中的候選KNOX基因。接著用Pfam(http://pfam.xfam.org/search)檢測(cè)各候選基因編碼蛋白質(zhì)的功能域,剔除功能域缺失基因。隨后用MEME(http://meme-suite.org/)進(jìn)一步確認(rèn)煙草KNOX保守功能域的序列,用ExPASY's Compute Pi/Mw(http://web.expasy.org/compute-pi)計(jì) 算 各 煙 草KNOX蛋白的分子量和等電點(diǎn)。基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)用 GSDS(http://gsds.cbi.p-ku.edu.cn/)進(jìn)行分析。隨后用DNAMAN V6.0比對(duì)各基因的基因序列和編碼區(qū)序列(Coding sequence,CDS),并進(jìn)行驗(yàn)證。

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中各基因所在的染色體信息,利用MapInsect軟件繪制各基因的染色體定位圖。用Knotted-1-like為關(guān)鍵詞搜索NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫,獲得其他植物中的KNOX同源基因。本研究中使用的同源基因分別來自擬南芥(Arabidopsis thaliana,AtKNAT1/NP_192555、AtKNAT2/NP_177208、AtKNAT3/NP_197904、AtKNAT4/NP_196667、AtKNAT5/NP_194932、AtKNAT6/AAF87007、AtKNAT7/AAG 408 58、AtSTM/Q38874)、石 斛 蘭(Dendrobium grex,DgDOH1/CAB88029)、牽牛花(Ipomoea nil,InPKn2/AB016000)、西 紅 柿(Lycopersiconesculentum,LeThox2/NP_001298112.1、 LeTKn3/AAD00252、Solyc07g007120、Solyc12g010410、Solyc08g041820、Solyc08g080120、Solyc04g077210、Solyc02g081120、Solyc01g100510)、水稻(Oryza sativa,OsHOS58/BAB 55658、OsHOS59/AB007628、OsHOS66/BAB55660、OsJNBa0035I24.10/AAR87205、OsJNB b0094O03.2/AAP68879、OsOSH1/JQ2379、OsOSH10/XP_469241、OsOSH15/NP_911093、OsOSH45/T03874、 OsOSH6/NP_914102、OsOSH71/BAA79226、Osrough_sheath1/BAA79225)、楊樹(Populus tremula,Pt568092/XP_002317151.3、Pt570713/XP_002318951.2、Pt581961/XP_024456722.1、Pt61066/XP_002304900.2、Pt658310/XP_002315682.3、 Pt662050/XP_024437653.1、 Pt 672778/XP_002324571.2、Pt738080/XP_002324571.2、Pt88373/PNT01023.1、PtKN1/XP_002301134.1、PtKN AT3/XP_024459660.1、PtKNAT3b/PNS92233.1、PtKN AT4/AKE81086.1、PtKNAT6/PNT25501.1、PtKNAT7/XP_002299569.2)、卷柏(Selaginella moellendorffii,SmKNOX1/EFJ21442、SmKNOX2/EFJ07541、SmKN OX3/EFJ05362、SmKNOX4/XP_002969147)、馬鈴薯(Solanum tuberosum,StPOTH1/T07777)、玉 米(Zea mays,ZmAZM440326/NP_001105852.1、 ZmAZM 459391/NP_001150419.1、Zmgn1/AAP76320、Zmkn1/AAP76321、Zmlg3/AAD13611、Zmlg4a/AAP31409、ZmRS1/Q41853)。利用Clustal X比對(duì)收集到的植物KNOX氨基酸序列,將比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入MEGA5,采用Neighbor-joining方法(自舉檢驗(yàn)1 000次)構(gòu)建植物KNOX的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 基因表達(dá)分析

采用熒光定量PCR方法檢測(cè)煙草KNOX基因在不同組織中的表達(dá)水平,各基因特異性引物見表1。qPCR反應(yīng)體系20μL,包括2×SYBR Green Master 10μL、基因上下游引物(10μmol/L)各1μL、cDNA模板(40 ng/μL)3 μL,加ddH2O補(bǔ)足至20 μL。qPCR反 應(yīng) 程 序:95℃ 3 min;95℃ 10 s,60℃30 s,45個(gè)循環(huán);信號(hào)采集,最后運(yùn)行熔解(65~95℃)程序。采集3株植物樣品混合為1個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)植物組織設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品各檢測(cè)3次。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)循環(huán)閾值(CT值),用 2-ΔΔCT或者 2-ΔCT

方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[34]。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草KNOX基因的鑒定

通過檢索中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫V4.0中普通煙草基因組的數(shù)據(jù),共獲得24個(gè)注釋為Homeobox protein knotted-1-like的基因,通過Pfam分析發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)基因編碼的蛋白缺少KNOX典型的KNOX I、KNOXⅡ或者ELK功能域。剔除后,共在普通煙草基因組中鑒定出18個(gè)NtKONX基因。分別在兩個(gè)二倍體祖先種絨毛狀煙草和林煙草中鑒定出5和8個(gè)KNOX基因。如表2所示,普通煙草NtKNOX基因編碼區(qū)長(zhǎng)度在903~1 281 bp之間,編碼的氨基酸長(zhǎng)度為300~426個(gè),蛋白質(zhì)分子量為33.87~47.10 kD,等電點(diǎn)4.61~6.58。祖先種絨毛狀煙草NtomKNOX基因均含有5個(gè)外顯子,林煙草中7個(gè)NsylKNOX基因含有5個(gè)外顯子,1個(gè)NsylKNOX基因含有6個(gè)外顯子。大多數(shù)普通煙草NtKNOX基因均含有至少5個(gè)外顯子,只有Ntab0202830和Ntab0782930基因ID含有4個(gè)外顯子,表明這兩個(gè)基因可能在四倍體煙草形成后發(fā)生了內(nèi)含子丟失。根據(jù)煙草KNOX基因之間以及與其他物種同源KNOX基因間的序列相似性,將普通煙草NtKNOX基因分為9組,分別命名為NtSTM和 NtKNAT1~8(表 3)。 林 煙 草 基 因 組 中 沒 有NsylKNAT1基因,而絨毛狀煙草中缺少NtomSTM、NtomKNAT1、NtomKNAT2和 NtomKNAT8基因。這表明絨毛狀煙草中KNOX基因家族可能發(fā)生了基因丟失現(xiàn)象。比對(duì)普通煙草NtKNOX基因序列與祖先種同源基因序列的相似性,發(fā)現(xiàn)每對(duì)NtKNOX基因中有1個(gè)與林煙草同源基因相似度更高,另外1個(gè)與絨毛狀煙草同源基因的相似性更高。因此,進(jìn)一步將普通煙草KNOX基因命名為NtKNOXS或NtKNOX-T(表3)。

表1 基因表達(dá)水平檢測(cè)引物Tab.1 Primers for detecting gene expression

2.2 煙草KNOX基因的染色體定位及進(jìn)化分析

為了明確各NtKNOX基因在普通煙草染色體組上的分布,繪制了18個(gè)NtKNOX基因在普通煙草各染色體上的分布圖,見圖1。18個(gè)NtKNOX基因有15個(gè)已經(jīng)明確定位到染色體上,分別分布在12條不同的染色體上,而NtKNAT3-T、NtKNAT6和NtKNAT7-S基因則位于目前尚未定位的片段重疊群(Scaffold)上。NtKNOX基因在12條染色體上的分布很分散,只有第4、6和18號(hào)染色體上含有兩個(gè)NtKNOX基因,其余9條染色體上各含有1個(gè)NtKNOX基 因(圖 1)。 其 中 NtKNAT2-TA/NtKNAT2-TB、NtKNAT8-TA/NtKNAT8-TB兩對(duì)基因序列幾乎完全一致,而且在4號(hào)和6號(hào)染色體上的距離非常接近,表明這兩對(duì)基因可能由同源基因復(fù)制產(chǎn)生。

表2 3個(gè)煙草種中KNOX基因信息Tab.2 Characteristics of KNOX genes in three tobacco species

表3 3個(gè)煙草種中KNOX同源基因的命名Tab.3 Homologous KNOX genes in three tobacco species

圖1 普通煙草NtKNOX基因的染色體分布Fig.1 Chromosome location of NtKNOX genes

根據(jù)玉米、擬南芥、石斛蘭、牽?;?、西紅柿、水稻、楊樹、卷柏、馬鈴薯和3個(gè)煙草種中KNOX的氨基酸序列,經(jīng)序列比對(duì)后用MEGA5軟件構(gòu)建植物KNOX的系統(tǒng)進(jìn)化樹,如圖2所示。植物KNOX基因家族被明顯地分為兩支:KNOXⅠ和KNOXⅡ。KNOXⅠ又可以被進(jìn)一步分為KNOXⅠ-A、KNOXⅠ-B和KNOXⅠ-C 3組。同樣,KNOXⅡ也可以繼續(xù)分為KNOXⅡ-A和KNOXⅡ-B兩組。KNOXⅠ和KNOXⅡ兩個(gè)大的分支均包含來自于單子葉植物和雙子葉植物的成員,表明這兩個(gè)分支的形成可能發(fā)生在單雙子葉植物分離之前。但KNOXⅠ-A和KNOXⅡ-A分支中的成員都來自于雙子葉植物,表明這兩支可能是雙子葉植物特有的KNOX蛋白。KNOXⅠ-B分支雖然包括單子葉植物和雙子葉植物成員,但成員數(shù)目和植物種類較少,擬南芥AtKNOX在該分支中則沒有分布,表明這個(gè)分支在植物中的分布可能不十分普遍。煙草KNOX蛋白在所有分支中均有分布,但在每個(gè)分支中其分布的數(shù)量并不相同。如煙草KNAT2和KNAT6分布在KNOXⅠ-A分支,該分支還包括來自擬南芥的AtKNAT2和AtKNAT6,這與之前對(duì)基因的命名一致。煙草KNAT8位于KNOXⅠ-B分支,STM和KNAT1位于KNOXⅠ-C分支;KNAT2、KNAT4和KNAT5位于KNOXⅡ-A分支,而KNAT7則位于KNOXⅡ-B分支(圖2)。

2.3 煙草KNOX基因結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域

通過分析煙草KNOX基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),所有煙草KNOX基因長(zhǎng)度都在4 kb以上,并且均含有3個(gè)以上的內(nèi)含子和4個(gè)以上的外顯子(圖3)。不同組煙草KNOX基因中內(nèi)含子長(zhǎng)度變化非常大,如KNOXⅠ-A組中各煙草KNOX基因包含的最大內(nèi)含子長(zhǎng)度在 5.6~22.8 kb,而 KNOXⅠ-B、KNOXⅠ-C和KNOXⅡ-B組中各煙草KNOX基因包含的最大內(nèi)含子長(zhǎng)度為3~3.6 kb;而KNOXⅡ-A組中各煙草KNOX基因中最大的內(nèi)含子長(zhǎng)度只有2.5 kb左右(圖3)。KNOXⅠ中各外顯子的長(zhǎng)度比較保守,如第1個(gè)外顯子(以KNOXⅠ-B中各基因排序)長(zhǎng)度為234~381 bp,第2個(gè)外顯子長(zhǎng)度為117~123 bp,第3個(gè)外顯子長(zhǎng)度為106~142 bp,第4個(gè)外顯子長(zhǎng)度為230~254 bp,第5個(gè)外顯子長(zhǎng)度為152~207 bp(圖3)。其中第2和第3個(gè)外顯子之間的內(nèi)含子在KNOXⅠ-C組中發(fā)生了丟失,形成了1個(gè)247 bp的外顯子。KNOXⅡ組中各煙草KNOX基因的第1個(gè)外顯子長(zhǎng)度變化較大,其余外顯子的長(zhǎng)度都比較保守。如各基因間第1個(gè)外顯子的長(zhǎng)度為318~699 bp,而第2個(gè)外顯子長(zhǎng)度均為121 bp,第3、4、5個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為190、132和141 bp。

圖2 植物KNOX家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of KNOX family in plants

通過序列的多重比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),煙草KNOX蛋白序列有4個(gè)相對(duì)保守的區(qū)域(圖4A),進(jìn)一步的功能域分析證實(shí)這4個(gè)區(qū)域依次是KNOX1、KNOX2、ELK和HOX(Homeobox KN)結(jié)構(gòu)域,并確定了每個(gè)位置上最大可能的氨基酸頻率(圖4B)。其中HOX結(jié)構(gòu)域的保守性最高,表現(xiàn)出TALE同源異型盒蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)特征,即第1和第2個(gè)螺旋間插入3個(gè)額外的氨基酸(P-Y-P)。這4個(gè)功能域在煙草KNOX基因上的分布與進(jìn)化分組密切相關(guān),如KNOX1功能域的編碼區(qū)分布在KNOXⅠ組各基因的第1和第2個(gè)外顯子上,而KNOXⅡ各基因的KNOX1功能域編碼區(qū)只存在于第1個(gè)外顯子上(圖3)。除了KNOXⅠ-C組中的基因外,幾乎所有煙草KNOX2功能域的編碼區(qū)都能被內(nèi)含子分開。ELK功能域的編碼區(qū)在KNOXⅠ組各基因中分布在同一外顯子上,而在KNOXⅡ各基因中是被內(nèi)含子分割成兩段。所有基因的HOX功能域編碼區(qū)都被最后1個(gè)內(nèi)含子分為兩部分(圖3)。

2.4 煙草KNOX基因的表達(dá)

普通煙草盛花期的葉、莖、根、花蕾、花和頂芽中NtKNOX基因的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果如圖5A和5B所示,所有煙草NtKNOX基因均在頂芽組織中的表達(dá)水平最高,而且各組織中KNOXⅡ類基因的表達(dá)水平整體高于KNOXⅠ類基因。此外,所有的NtKNOXⅡ類基因還在根和花中表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平,而大多數(shù)NtKNOXⅠ類基因在其他組織中的表達(dá)水平均很低,除了根中高表達(dá)的NtKNAT1和NtKNAT8基因(圖5A)。在不同發(fā)育時(shí)期的林煙草中,NsylKNAT4基因的表達(dá)水平在根中始終最高,而在葉片中表達(dá)水平最高的是NsylKNAT3和NsylKNAT5基因(圖5C)。NsylKNAT3和NsylKNAT5基因在幼苗期根中的表達(dá)水平很低,但在成熟期根中明顯升高,同樣的成熟期葉片中NsylKNAT7基因的表達(dá)水平也明顯升高。絨毛狀煙草中NtomKNAT3基因在根和葉中表達(dá)水平均很高(圖5D),而NtomKNAT7主要在根中表達(dá),NtomKNAT5主要在葉中表達(dá)。這種組織表達(dá)的差異性表明煙草KNOX基因的功能存在明顯分化。

圖3 煙草KNOX基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structures of KNOX genes from tobacco

3 討論

普通煙草被認(rèn)為是由兩個(gè)二倍體祖先種林煙草和絨毛狀煙草雜交后,經(jīng)染色體加倍形成的異源四倍體[35]。理論上普通煙草中NtKNOX同源基因的數(shù)目應(yīng)等于林煙草和絨毛狀煙草中KNOX同源基因數(shù)目的總和,但序列比對(duì)和進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),林煙草基因組中沒有NsylKNAT1基因,而絨毛狀煙草中則缺少NtomSTM、NtomKNAT1、NtomKNAT2和NtomKNAT8基因。相反,普通煙草中NtKNAT2-T和NtKNAT7-T則進(jìn)一步發(fā)生了同源復(fù)制,表明在二倍體煙草(尤其是絨毛狀煙草)中KNOX基因家族趨于縮減,而在四倍體煙草中則逐漸擴(kuò)張。煙草KNOXⅠ類成員的進(jìn)化途徑可分為3個(gè)分支(即KNOXⅠ-A、KNOXⅠ-B和KNOXⅠ-C),而KNOXⅡ類成員的進(jìn)化則分為2個(gè)分支,各分支成員間的基因結(jié)構(gòu)(包括長(zhǎng)度、內(nèi)含子數(shù)目等)發(fā)生了明顯變化。前人研究表明,KNOX基因結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)間存在很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系[36],因此這種基因結(jié)構(gòu)的變化可能導(dǎo)致煙草各KNOX同源基因的功能分化及產(chǎn)生新的功能?;虮磉_(dá)的分析結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論,普通煙草中NtKNOXⅡ基因幾乎在所有組織中的表達(dá)水平都高于NtKNOXⅠ基因,而NtKNOXⅠ基因除了在頂芽中表達(dá)水平很高之外,在其他組織中表達(dá)水平均很低。這種KNOX基因的表達(dá)模式與已報(bào)道的其他物種一致,表明植物KNOX蛋白在功能上可能具有高度的保守性[5,37]。此外,還發(fā)現(xiàn)二倍體煙草根和莖中有不同的基因表現(xiàn)出最高的表達(dá)水平,預(yù)示著其功能的明確分化。而在普通煙草中所有NtKNOX基因的表達(dá)模式很接近,表明與野生祖先種相比,NtKNOX各成員的功能在普通煙草形成過程中發(fā)生了變化。目前,越來越多的植物KNOX基因以及與其相互作用的基因被陸續(xù)鑒定出來[38]。KNOX的功能除了最初的調(diào)控植物形態(tài)發(fā)育外[18],還調(diào)控了植物多種激素[5]和次生代謝物[27]的合成代謝。因此,深入分析煙草KNOX基因家族成員的結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式,將有助于進(jìn)一步揭示不同植物中KNOX基因的進(jìn)化關(guān)系,為研究該類基因在煙草中的功能奠定基礎(chǔ)。

圖4 煙草KNOX蛋白功能域分析Fig.4 Functional domain analysis of KNOX proteins from tobacco

圖5 煙草KNOX基因的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of KNOX genes from tobacco

4 結(jié)論

本研究中分別從普通煙草、林煙草和絨毛狀煙草中鑒定出18、8和5個(gè)KONX基因。根據(jù)序列的相似性,將煙草KNOX基因分為9組,分別命名為STM和KNAT1~8。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,煙草KNOX蛋白在所有分支中均有分布,但是每個(gè)分支中分布的數(shù)量并不相同,表明煙草KNOX的進(jìn)化是連續(xù)而又有所偏重。同一進(jìn)化分支中煙草KNOX蛋白的功能域以及其編碼序列在基因結(jié)構(gòu)上的分布高度保守,預(yù)示著其功能的冗余。普通煙草中NtKNOXⅡ類基因的表達(dá)水平整體高于NtKNOXⅠ類基因,林煙草根和葉片中表達(dá)水平最高的基因分別是NsylKNAT4和NsylKNAT3/NsylKNAT5,絨毛狀煙草中NtomKNAT3基因在根和葉中表達(dá)水平均很高,而NtomKNAT7主要在根中表達(dá),NtomKNAT5主要在葉中表達(dá)。

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