周金虎，陳茂彬，毛志海，方尚玲

（1.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北工業(yè)大學(xué)），工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430068； 2.湖北華信制藥有限公司，湖北通城437400）

糯米酒，又稱江米酒、甜酒、酒釀、醪糟，主要原料是糯米，釀制工藝簡(jiǎn)單，口味香甜醇美，乙醇含量極少，主要含有糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，適宜各類人群食用，因此深受人們喜愛(ài)。不同的甜酒曲釀制的米酒口感風(fēng)格迥異[1]。

目前市場(chǎng)上銷售的甜酒曲共分為傳統(tǒng)土曲、現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)的甜酒曲、純種的根霉曲3類，質(zhì)量參差不齊[2]?，F(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)的甜酒曲主要含有酵母菌和根霉，而純種的根霉曲中就只有單一的根霉，傳統(tǒng)土曲是由根霉、毛菌、細(xì)菌、酵母菌等多種微生物及米粉、辣蓼草等中草藥制作而成，釀制的米酒芳香獨(dú)特，口感香醇，但甜度不夠，主要是因?yàn)橥燎谂囵B(yǎng)的過(guò)程中有多種微生物共同生長(zhǎng)，但卻沒(méi)有糖化力較強(qiáng)的菌株，而根霉菌的特性之一就是有較強(qiáng)的糖化酶活力[3]。由此可見(jiàn)，甜酒曲都需要有較強(qiáng)糖化力的根霉菌。甜酒曲的質(zhì)量直接影響米酒的品質(zhì)及產(chǎn)量，因此研究甜酒曲中的根霉菌具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。鑒于此，本研究著重從4種不同的甜酒曲中篩選出糖化力較強(qiáng)的根霉菌，并通過(guò)18S rDNA分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定，以期與同行共同探討學(xué)習(xí)。

1 材料與方法

1.1 材料

四川大竹東柳酒曲（網(wǎng)購(gòu)），孝感蜂窩酒曲（孝感市王齊庵酵母有限公司），安琪甜酒曲（安琪酵母股份有限公司），蘇州蜜蜂甜酒曲（江蘇微康生物科技有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g去皮，切塊加熱煮沸30 min，用紗布過(guò)濾得過(guò)濾液，再加葡萄糖20 g和瓊脂粉20 g，用純水定容至1000 mL。

平板透明圈培養(yǎng)基[4]：可溶性淀粉0.4 g，氯化鈉1.0 g，牛肉膏1.0 g，蛋白胨2.0 g，脫氧膽酸鈉0.4 g，瓊脂粉4.0 g，加純水定容至200 mL。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮10.0 g，自來(lái)水8.0 mL，磷酸二氫鉀0.02 g，硫酸鎂0.02 g，硝酸鈉0.3 g。

1.3 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱、721型紫外分光光度計(jì)、電磁爐、高溫高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、電泳儀、純水儀、離心機(jī)等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 霉菌的分離與純化

1.4.1.1 分離方法

稀釋涂布平板法：分別稱取5 g不同的甜酒曲于50 mL帶玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水中，在搖床中振蕩30 min，靜置10 min。再用移液槍分別吸取1 mL上清液于9 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振蕩后得到10-2的稀釋液，以此類推，分別稀釋至10-3、10-4、10-5。接種梯度為10-3、10-4、10-5，以上梯度分別吸取0.2 mL稀釋液于PDA培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行均勻涂布，做好標(biāo)記，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1～2 d。

1.4.1.2 純化方法

平板劃線法：將分離出的不同菌落形態(tài)的霉菌進(jìn)行編號(hào)，描述菌落形態(tài)并計(jì)數(shù)，然后在超凈工作臺(tái)中挑取各個(gè)編號(hào)的單菌落在相應(yīng)的平板上進(jìn)行劃線，做好標(biāo)記，每株菌做兩個(gè)平行。劃線后置于相應(yīng)溫度恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。菌種培養(yǎng)條件參照1.4.1.1。

1.4.2 平板透明圈初篩

將試管斜面上生長(zhǎng)良好的霉菌孢子點(diǎn)接到平板透明圈培養(yǎng)基上，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36～48 h，然后分別測(cè)定HC值。

1.4.3 比色法測(cè)定霉菌糖化酶活力[5]

1.4.3.1 固體發(fā)酵培養(yǎng)

稱取相當(dāng)于絕干重10 g的麩皮，按比例依次稱取試劑，潤(rùn)料2 h，然后于121℃下滅菌30 min，趁熱打散，冷卻至30℃左右，加入1 mL孢子懸液，混勻后于30℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h（18～24 h時(shí)扣瓶）左右。

1.4.3.2 粗酶液的提取

于發(fā)酵完畢的三角瓶中，加入35℃的水至加緩沖溶液后的總體積為200 mL[加水量=(200-20-試樣中的水量)mL]。然后加入20 mL pH4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，充分?jǐn)噭颍?5℃保溫浸泡l h。保溫期間每隔15 min攪拌1次。用脫脂棉過(guò)濾，棄去數(shù)毫升初濾液，得澄清濾液供測(cè)定用。

1.4.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取1.00 g葡萄糖，定容至1000 mL，得到l mg/mL的葡萄糖儲(chǔ)存液，分別吸取0、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL的葡萄糖溶液，分別加入蒸餾水10 mL、9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL，制成系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，取l mL標(biāo)準(zhǔn)液，加入1.5 mL的DNS試劑，在沸水浴中加熱5 min，立即用水冷卻，然后用蒸餾水定容至25 mL，混勻，在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定吸光度值。繪制反應(yīng)液中的葡萄糖含量與吸光度值的關(guān)系曲線。以不加葡萄糖的反應(yīng)液作為對(duì)照。

1.4.3.4 酶活測(cè)定

取5 mL 2%可溶性淀粉溶液于試管中，然后加入5 mL稀釋10倍的粗酶液，40℃保溫反應(yīng)10 min，立即在沸水浴中煮沸，停止反應(yīng)。取反應(yīng)液l mL，加入l mL蒸餾水，然后加入1.5 mL的DNS顯色劑，在沸水浴中加熱5 min，立即用水冷卻，定容至25 mL，混勻，在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定其吸光度值。以蒸餾水作對(duì)照。

1.4.3.5 酶活定義

1 g絕干曲在40℃、pH4.6條件下1 h生成l mg葡萄糖為1個(gè)酶活單位，U/g干曲。

計(jì)算公式：X=N×60/10×V÷M×A÷k

式中：X，為酶活力單位，U/g；N，為干曲稀釋倍數(shù)；60/10，為定義時(shí)間與實(shí)際反應(yīng)時(shí)間之比；V，為粗酶液定容體積；M，為所取用于反應(yīng)的酶液體積；A，為實(shí)際所測(cè)樣品的吸光度值；k，為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.4.4 目標(biāo)菌株的分子生物學(xué)鑒定

以目標(biāo)菌株的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳。將擴(kuò)增出的18S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)中的序列進(jìn)行對(duì)比，應(yīng)用MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，找出和該菌株相近的種、屬[6-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離與純化

根據(jù)稀釋涂布平板上單菌落的形態(tài)特征初步選定7株霉菌進(jìn)行初篩。圖1為部分菌落平板圖片。

圖1 部分霉菌純化圖

2.2 菌株的初篩

將分離純化的霉菌孢子分別點(diǎn)接到平板透明圈培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)36～48 h，然后分別測(cè)定HC值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 7株霉菌的HC值

通過(guò)透明圈法對(duì)分離出的7株霉菌進(jìn)行初步篩選。淀粉透明圈培養(yǎng)基中的淀粉被根霉分泌出的淀粉酶分解后，菌落周圍會(huì)產(chǎn)生透明圈，淀粉酶活力越強(qiáng)，透明圈越大，反之越小[9]。由表1可以看出，HC值＞2的有3株，3#霉菌HC值最大為2.32，其次是7#霉菌，為2.16，6#霉菌為2.08，HC值＜2的有5株。選擇HC值＞2的菌株，即3#、6#、7#霉菌進(jìn)行復(fù)篩。

2.3 酶活測(cè)定

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2，結(jié)果表明，曲線的線性相關(guān)性很好，對(duì)曲線作回歸分析得相關(guān)系數(shù)R2=0.9901，回歸方程式為y=0.9480x-0.0250，式中：y表示測(cè)定的吸光度(OD值)；x表示還原糖的濃度，mg/mL；0.0250表示補(bǔ)償參數(shù)。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 比色法測(cè)定糖化酶活力（表2）

表2 糖化酶活力的測(cè)定

由表2可知，3#霉菌糖化酶活力最高，為1972.2 U/g，這與平板透明圈初篩結(jié)果一致，所以選擇3#霉菌作為目標(biāo)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定[9-10]。

2.4 目標(biāo)菌株的分子生物學(xué)鑒定

將3#霉菌擴(kuò)增得到的18S rDNA序列與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較，從GenBank中獲得和該菌株序列相近種、屬的18S rDNA序列，應(yīng)用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見(jiàn)圖3。

由圖3可看出，菌株3#與米根霉的同源性最高，相似度達(dá)99%，可確定3#為Rhizopus oryzae。

圖3 3#菌株18S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

以3#霉菌的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增18S rDNA序列，大小為603 bp，其電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 3#菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從4種不同的甜酒曲中共分離出7株霉菌。分別采用平板透明圈法、比色法測(cè)定所有菌株的糖化酶活力，篩選到1株高產(chǎn)淀粉酶的3#霉菌，糖化酶活力達(dá)1972.2 U/g。將3#霉菌擴(kuò)增得到的18S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較，從GenBank中獲得和該株序列相近種、屬的18S rDNA序列，應(yīng)用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，得出菌株3#與米根霉的同源性最高，相似度達(dá)99%，可確定3#霉菌為米根霉（Rhizopus oryzae）。