高新梅，張金民，崔桂賓，孫風麗，張 超，劉曙東，奚亞軍

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.商丘市農(nóng)林科學(xué)院,河南商丘 476000)

SPL(SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE) 基因家族具有高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)控植物根系的生長、葉片的發(fā)育、分枝/分蘗的生長、穗結(jié)構(gòu)的形成以及對激素的響應(yīng)等，在所有的綠色植物中都有發(fā)現(xiàn)[1]。2010年，Jiao[2]和Miura等[3]同時在水稻中克隆獲得OsSPL14/OsIPA1基因，并發(fā)現(xiàn)該基因表達量受miRNA156調(diào)控，影響水稻株型的發(fā)育。OsSPL14基因過量表達會抑制水稻無效分蘗的生成，使莖稈粗壯，增加抗倒伏能力，最終可使產(chǎn)量增加10%[2]。近年來，在水稻中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)OsSPL7、OsSPL17和OsSPL16基因可以負向調(diào)控水稻分蘗的形成[4-5]；OsSPL16、OsSPL13正向調(diào)控水稻谷粒的大小[5-6]；OsSPL14在不同組織中的差異表達受泛素化水平調(diào)控[7]，能夠直接與株型相關(guān)基因TB1以及獨角金內(nèi)酯(SLs)信號途徑的D53結(jié)合[8-9]，調(diào)控水稻植株形態(tài)的建成。與水稻相比，小麥SPL基因的研究較為滯后，2014年，Zhang等[10]對小麥基因組進行生物信息學(xué)分析，并預(yù)測了小麥中8個SPL基因的功能。通過分析不同種質(zhì)資源SPLs基因等位點變化與農(nóng)藝性狀的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TaSPL20/TaSPL21對小麥株高和千粒重有較大影響[11]。TaSPL3和TaSPL17的基因序列中含有miRNA156識別位點，與OsSPL14有較高的同源性，可以上調(diào)分蘗相關(guān)基因TaTB1的表達，而這一過程受到TaD53的調(diào)控[12-13]，說明TaSPL13/17基因參與SLs信號途徑對小麥分蘗發(fā)育的調(diào)控過程。

獨腳金內(nèi)酯(SLs)作為一種新型植物激素，主要在植物根部合成后通過莖部向上運輸，具有刺激寄生植物列當和獨腳金種子的萌發(fā)、抑制植物分枝形成、調(diào)控植物根系生長和葉片衰老等生物學(xué)功能[14]。生長素是最早被用于植物科學(xué)研究的激素之一，主要在植物根尖、莖尖、初生葉片等幼嫩組織中合成，經(jīng)過極性運輸可以使不同器官之間出現(xiàn)生長素濃度差，調(diào)控植物的向性生長、根系的發(fā)育、分枝/分蘗的形成等植株形態(tài)的建成[15]。細胞分裂素常與其他激素一起調(diào)控植物的生長發(fā)育[16]。研究發(fā)現(xiàn)，獨腳金內(nèi)酯(SLs)、生長素(IAA)和細胞分裂素(CTK)在調(diào)控植株根系發(fā)育與分枝/分蘗的生長方面具有一定的聯(lián)系，三者相互作用，共同影響植株形態(tài)的建成[17-18]。

張鐵懷等[19]對TaSPL17基因進行半定量分析，發(fā)現(xiàn)該基因在小麥莖基部和根部都有表達；Kerr等[20]進一步研究發(fā)現(xiàn)，TaSPL17基因可以直接與SLs信號途徑相互作用，調(diào)控植株分蘗的生長；目前尚未發(fā)現(xiàn)TaSPL17基因與IAA和CTK信號途徑間的關(guān)系。為了探索獨腳金內(nèi)酯、生長素和細胞分裂素等途徑與TaSPL17基因的關(guān)系，本研究使用不同濃度的獨腳金內(nèi)酯人工合成類似物GR24、生長素IAA、細胞分裂素6-BA處理小麥幼苗，檢測TaSPL17基因的表達情況，探究TaSPL17基因與三種激素信號的關(guān)系，以期為TaSPL17基因的作用機制以及SLs、IAA和CTK三大激素信號途徑的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用材料為陜西關(guān)中地區(qū)小麥主栽品種小偃22，選用當年收獲的種子。取籽粒飽滿，大小一致的小麥種子，使用砂培法進行種子萌發(fā)。7天后，挑選長勢一致的幼苗在培養(yǎng)箱中進行水培。培養(yǎng)條件為15 ℃暗培養(yǎng)10 h，20 ℃光照培養(yǎng)14 h，光量子密度為300 μmol·m-2·s-1(TES-1339)。水培液為1/2霍格蘭氏營養(yǎng)液，每隔2 d 更換一次培養(yǎng)液。幼苗長至三葉期時，選取長勢相同的植株分別種在不同的花盆進行水培，每盆4株。

1.2 激素處理

在培養(yǎng)液中分別施加不同濃度的獨腳金內(nèi)酯人工合成類似物GR24、生長素IAA和細胞分裂素6-BA，進行激素處理。GR24處理濃度為0、0.04、0.4和4 μmol·L-1，IAA和6-BA處理濃度相同，均為0、0.001、0.1和10 μmol·L-1。培養(yǎng)5 h，重復(fù)3次。取小麥根部和0.5 cm的莖基部在液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 TaSPL17 基因的表達分析

用RNAiso Plus(TaKaRa，日本)提取小麥總RNA。用PrimeScripTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)按照說明書進行cDNA第一鏈的合成。以TaActin基因(F:GCCGTTCTGTCC TTGTATGC，R:CCTGACCATCAGGCATCT CA)為內(nèi)參，用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒(TaKaRa，日本)在QuantStudioTM 7 FlexReal-Time PCR System (ABI，美國)進行實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)，檢測TaSPL17基因(F:CGACTCGCCG CATCCTTT，R:CTGCTGTATGCG TGGTGGC)的相對表達量。反應(yīng)體系與程序按照試劑盒說明書進行，其中循環(huán)數(shù)為40，退火溫度為60℃，延伸時間為31 s。

用2-△△CT法計算TaSPL17基因的相對表達量，用IBM SPSS Statistics 22 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和LSD多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GR24對小麥苗期TaSPL17基因表達的影響

為了研究SLs對小麥苗期TaSPL17基因表達的調(diào)控，用不同濃度的GR24處理小麥幼苗根系，利用qRT-PCR技術(shù)檢測TaSPL17基因的相對表達量，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的GR24處理后，小麥根部和莖基部TaSPL17基因的表達量均出現(xiàn)極顯著下降，其表達水平與處理所用的GR24濃度成反比。與根部相比，小麥莖基部TaSPL17基因表達量的下降程度較高，在GR24濃度為0.04 μmol·L-1時即下降了70%左右，而根中只下降了30%左右，但隨著濃度的增加，莖基部TaSPL17的表達量變化不如根中明顯。這進一步說明，在調(diào)控小麥苗期根系的生長和莖基部發(fā)育中，TaSPL17基因與SLs途徑有一些聯(lián)系，特別是在調(diào)控小麥莖基部發(fā)育時，二者關(guān)系較為密切。

* 和**分別表示激素處理與對照間差異顯著(P<0.05)和極顯著P<0.01)。下同。

*and** mean significant difference between hormone treatments and CK at 0.05 and 0.01 levels,respectivly.The same in tables 2 and 3.

圖1GR24對小麥苗期根部和莖基部TaSPL17基因表達的影響

Fig.1EffectofGR24onTaSPL17geneexpressionattherootandstembaseofwheatseedlings

2.2 外源IAA對小麥苗期 TaSPL17 基因表達的影響

在探究TaSPL17基因與IAA信號的關(guān)系中，參考經(jīng)典的植物根、莖、芽對生長素敏感性曲線，采用不同濃度的IAA處理小麥幼苗，檢測TaSPL17基因的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源施加IAA可以顯著下調(diào)小麥苗期TaSPL17基因的表達(圖2)。與正常小麥植株相比，外源施加IAA會使小麥苗期根部和莖基部TaSPL17基因的表達量出現(xiàn)極顯著性下降；并且IAA處理濃度為0.1 μmol·L-1(促進芽生長的最適濃度)時，TaSPL17基因在2個部位中的表達量均降到最低，繼續(xù)增加IAA的濃度，TaSPL17的表達量反而上升。進一步對比TaSPL17在根部和莖基部對生長素的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在IAA濃度為0.001 μmol·L-1時根中TaSPL17的表達量降低了51%，而莖基部中降低了82%。說明在小麥苗期根部與莖基部的生長發(fā)育中TaSPL17基因與生長素途徑具有一定的聯(lián)系，其中二者在莖基部的聯(lián)系更加緊密。

2.3 6-BA對小麥苗期 TaSPL17 基因表達的影響

細胞分裂素是調(diào)控植物器官發(fā)育的重要植物激素之一，有關(guān)研究認為其主要是和生長素協(xié)同作用調(diào)控分生組織的分化。IAA/CTK比值直接影響植物側(cè)根發(fā)育與腋芽分生組織的分化[21]。用不同濃度的6-BA處理小麥幼苗，檢測小麥苗期根部和莖基部TaSPL17基因的表達情況。從圖3可以發(fā)現(xiàn)，與對照相比，外源施加6-BA使小麥幼苗根部和莖基部的TaSPL17基因表達量出現(xiàn)顯著降低；其中根部TaSPL17基因在6-BA處理濃度為0.001 μmol·L-1時表達量最低，并且隨著6-BA處理濃度的升高基因的表達量出現(xiàn)上升趨勢；而莖基部TaSPL17基因的表達量隨6-BA處理濃度的升高持續(xù)下降。表明在小麥苗期根系和莖基部分蘗芽的生長中，TaSPL17基因與6-BA所起的作用有一定的聯(lián)系。

圖2 IAA對小麥苗期根部和莖基部 TaSPL17 基因表達的影響

圖3 6-BA對小麥苗期根部和莖基部 TaSPL17 基因表達的影響

3 討 論

植物根的形成與多種因素有關(guān)，生長素在其中起關(guān)鍵作用，適宜濃度的生長素可以直接促進側(cè)根原基的啟動[22]，也可以通過調(diào)控根部細胞分裂素的合成來影響不定根的發(fā)生[23]。細胞分裂素可以獨立調(diào)控不定根的發(fā)育，也可以與生長素共同作用調(diào)控根的發(fā)育[24]。獨腳金內(nèi)酯可以依賴于不同植物激素，正向調(diào)節(jié)擬南芥初級根的伸長和分生組織細胞數(shù)的增加，負向調(diào)節(jié)側(cè)根的形成，如GR24處理擬南芥幼苗可以降低根部生長素運輸載體PIN1的濃度，調(diào)節(jié)根部參與側(cè)根原基發(fā)育的生長素通量，進而調(diào)控側(cè)根的生長發(fā)育[25-26]。

本研究發(fā)現(xiàn)IAA、6-BA、GR24處理小麥幼苗，都可以使小麥根部TaSPL17基因的表達量降低，說明TaSPL17對小麥苗期不定根生長的作用，有一部分可以通過生長素、細胞分裂素和獨腳金內(nèi)酯途徑完成。并且本研究參考經(jīng)典的植物根、莖、芽對生長素敏感性曲線，進行不同濃度IAA處理小麥幼苗，發(fā)現(xiàn)TaSPL17基因的表達在0.1 μmol·L-1處出現(xiàn)了最低值，推測TaSPL17基因與 IAA信號途徑關(guān)系較為密切。Yu等[27]在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，miRNA156過量表達或者其靶基因SPLs缺失都可以增加擬南芥?zhèn)雀臄?shù)量；外源施加生長素IAA，處理12 h后，miRNA156和SPLs都有極顯著的增加，說明miRNA156-SPLs參與了生長素對擬南芥?zhèn)雀l(fā)育的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，在外源IAA處理后，TaSPL17基因表達量出現(xiàn)下降，這與Yu等[27]發(fā)現(xiàn)的AtSPLs表達水平上升的結(jié)果相反，這可能與供試物種與時間不同有關(guān)，具體原因還有待進一步驗證。

生長素主要在植物根尖、莖尖、初生葉片等幼嫩組織中合成，由植物形態(tài)學(xué)上端極性運輸?shù)叫螒B(tài)學(xué)下端，抑制側(cè)芽的生長，形成頂端優(yōu)勢。細胞分裂素可以直接下調(diào)分蘗相關(guān)基因TB1/BRC1的表達來激活側(cè)芽的生長，獨腳金內(nèi)酯可以直接或間接上調(diào)TB1/BRC1的表達來抑制側(cè)芽的生長，二者對TB1/BRC1調(diào)控過程是分開獨立的[28-29]。對豌豆和擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，生長素可以通過調(diào)控細胞分裂素和獨腳金內(nèi)酯生物合成相關(guān)基因的表達調(diào)節(jié)莖間細胞分裂素和獨腳金內(nèi)酯的濃度，進而影響側(cè)芽的生長[30-31]。同時，細胞分裂素和獨腳金內(nèi)酯也可以通過調(diào)控莖中生長素運輸載體PIN1的濃度調(diào)節(jié)側(cè)芽處生長素的濃度[32]。由此可見，植物分枝/分蘗的形成是由生長素、細胞分裂素和獨腳金內(nèi)酯等激素相互作用，共同調(diào)控的結(jié)果。

本研究用IAA、6-BA、GR24處理小麥幼苗，發(fā)現(xiàn)小麥莖基部TaSPL17基因的表達量都會出現(xiàn)顯著下調(diào)，說明TaSPL17基因在調(diào)控小麥苗期分蘗芽生長過程中，可能參與了生長素、細胞分裂素和獨腳金內(nèi)酯途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，TaSPL17基因可以直接與分蘗相關(guān)基因TB1結(jié)合，激活TB1的轉(zhuǎn)錄，抑制植株分蘗的形成，并且在分子機制的研究中發(fā)現(xiàn)，TaD53可以在一定程度上抑制TaSPL17基因與TB1結(jié)合，同時過量的SLs可以反饋調(diào)節(jié)TaD53基因，使TaD53蛋白發(fā)生降解[9,13]。本試驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度的GR24處理小麥幼苗，可以抑制小麥莖基部TaSPL17基因的表達，推測外源施加GR24會使小麥中TaD53發(fā)生降解，對TaSPL17基因與分蘗相關(guān)基因TB1結(jié)合的抑制作用減弱，使TaSPL17基因的轉(zhuǎn)錄水平下降。