徐藝庭，蘇美仙

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診重癥醫(yī)學(xué)科，昆明 650101)

膿毒癥是重癥監(jiān)護病房最常見的嚴重疾病，發(fā)病率高、病死率高且預(yù)后較差。最新膿毒癥定義為宿主對感染反應(yīng)異?；蚴д{(diào)引起的危及生命的器官功能障礙[1]。腎臟是膿毒癥最常累及的器官之一，急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是膿毒癥患者最常見的并發(fā)癥。膿毒癥患者并發(fā)AKI時的住院時間更長、消耗更多的醫(yī)療資源，且總體患病率、病死率增加[2]。研究表明，膿毒癥致AKI的發(fā)病機制與非膿毒癥所致AKI完全不同，其病理生理過程更為復(fù)雜，且涉及多種因素，包括缺血缺氧性損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、腎小管上皮細胞凋亡、微血管功能障礙和內(nèi)皮功能障礙等[3-5]。有研究表明，炎癥反應(yīng)和細胞凋亡是膿毒癥致AKI的主要致病因素，而不再是血流動力學(xué)障礙或缺血性損傷[6]。腎小管上皮細胞依賴胱天蛋白酶家族發(fā)生的凋亡起關(guān)鍵的主導(dǎo)性作用[7-8]。胱天蛋白酶3作為細胞凋亡信號通路中的重要執(zhí)行組成員，將為膿毒癥AKI提供新的治療靶點或新的生物學(xué)標(biāo)志物?，F(xiàn)就胱天蛋白酶3在膿毒癥致AKI中的相關(guān)作用予以綜述。

1 胱天蛋白酶3的生物學(xué)特性

胱天蛋白酶是一類蛋白水解酶，屬于高度保守的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族，也是白細胞介素(interleukin，IL)1β轉(zhuǎn)換酶家族的成員[9]。胱天蛋白酶常存在于多細胞生物的細胞質(zhì)中，參與許多細胞內(nèi)的組織形態(tài)學(xué)變化過程。胱天蛋白酶相關(guān)的蛋白酶家族成員除氨基酸序列相近外，還具有近似的結(jié)構(gòu)構(gòu)成和底物特異性，通常以無活性的蛋白酶原形式存在，需要水解其N端的一段序列引起激活過程，活化后發(fā)生蛋白水解取得活性。

目前，胱天蛋白酶家族由15個成員組成，分為炎癥相關(guān)胱天蛋白酶和凋亡相關(guān)胱天蛋白酶2個主要亞家族。胱天蛋白酶家族在細胞炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中均起到關(guān)鍵性作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，胱天蛋白酶的功能與包括線蟲、果蠅、小鼠和人類在內(nèi)的多種生物的程序性細胞死亡和凋亡過程有密切聯(lián)系[11]。胱天蛋白酶家族成員能夠形成胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，在誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生的進程中起核心作用，從而決定細胞命運、調(diào)節(jié)免疫、細胞增殖和分化等進程。此外，凋亡相關(guān)胱天蛋白酶可進一步分為啟動相關(guān)胱天蛋白酶和執(zhí)行相關(guān)胱天蛋白酶。胱天蛋白酶3是執(zhí)行相關(guān)胱天蛋白酶中參與細胞凋亡的重要執(zhí)行因子，是最常見被激活的凋亡相關(guān)蛋白酶，也被稱為32 kD半胱氨酸蛋白酶或凋亡素，屬于秀麗線蟲凋亡基因3亞家族。胱天蛋白酶3是催化許多主要細胞蛋白切割的關(guān)鍵，可直接特異性剪切聚腺苷二磷酸核糖聚合酶、凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物、溶膠蛋白和α胞襯蛋白等多種胱天蛋白酶底物。胱天蛋白酶3還能特異性剪切胱天蛋白酶原3、胱天蛋白酶原6、胱天蛋白酶原7和胱天蛋白酶原9，廣泛參與細胞凋亡的過程。

2 胱天蛋白酶3與膿毒癥致AKI

2.1胱天蛋白酶3與細胞凋亡 細胞凋亡是細胞的程序性死亡，包括胱天蛋白酶家族的活化、完整質(zhì)膜破壞、DNA斷裂和凋亡小體的形成[12]。胱天蛋白酶家族是細胞凋亡過程的關(guān)鍵調(diào)控部分，是組織發(fā)展和平衡維持的關(guān)鍵。胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)在細胞凋亡的信號誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴增中起重要作用，同時其活化及功能還受凋亡蛋白相關(guān)抑制劑、B細胞淋巴瘤/白血病2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)蛋白家族、鈣蛋白酶和鈣離子等多種分子的調(diào)控。細胞凋亡過程中涉及死亡受體相關(guān)外源性途徑，線粒體相關(guān)內(nèi)源性途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活途徑等多種激活途徑，還涉及胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9等的活化過程[13]。但不同細胞凋亡途徑均經(jīng)過激活胱天蛋白酶3而發(fā)揮作用，并最終引起細胞死亡。胱天蛋白酶3作為細胞凋亡過程的關(guān)鍵成員，在執(zhí)行細胞凋亡過程中起重要作用。細胞凋亡過程一旦開始，上游起始胱天蛋白酶促使胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生激活，最終引起由執(zhí)行組胱天蛋白酶(胱天蛋白酶3，胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7)參與的DNA斷裂與關(guān)鍵蛋白裂解?，F(xiàn)分別介紹外源性途徑和內(nèi)源性途徑中胱天蛋白酶家族尤其是胱天蛋白酶3的重要作用。

2.1.1死亡受體相關(guān)的外源性細胞凋亡途徑 外源性細胞凋亡途徑由細胞膜表面的死亡受體引起細胞凋亡的發(fā)生，死亡配體主要有凋亡相關(guān)因子配體、腫瘤壞死因子α、增殖誘導(dǎo)配體、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體等，可與其各自的細胞表面死亡受體，如凋亡相關(guān)因子Fas又稱CD95、1型腫瘤壞死因子受體、死亡受體3、死亡受體4、死亡受體5等結(jié)合。死亡信號從死亡受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至死亡結(jié)構(gòu)域，通過胞質(zhì)內(nèi)的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與胱天蛋白酶原8的死亡結(jié)構(gòu)域互相作用，使定位于質(zhì)膜胞質(zhì)側(cè)的胱天蛋白酶原8發(fā)生募集，構(gòu)成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，隨后將死亡信號從凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游，引起胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，即胱天蛋白酶原8被激活形成活化的胱天蛋白酶，它可以切割和激活下游胱天蛋白酶執(zhí)行組成員(如胱天蛋白酶3)。胱天蛋白酶8下游途徑的活化隨不同的細胞類型有所變化。Ⅰ型細胞(淋巴系細胞)中，胱天蛋白酶8被大量激活并可直接活化下游的胱天蛋白酶3；在Ⅱ型細胞(非Ⅰ型細胞)中，胱天蛋白酶8不能直接激活胱天蛋白酶3，而是被IL-1、IL-6等細胞因子激活發(fā)生作用，經(jīng)過剪切細胞質(zhì)中一種促凋亡蛋白Bid(Bcl-2家族成員)的活性形式截短型Bid片段來激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，使細胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等從線粒體釋放出來,從而誘導(dǎo)細胞凋亡過程的發(fā)生。

2.1.2線粒體相關(guān)的內(nèi)源性細胞凋亡途徑 內(nèi)源性細胞凋亡途徑由細胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)觸發(fā)，引起線粒體外膜通透性的改變以及線粒體蛋白(如細胞色素C)的釋放。細胞色素C和凋亡酶激活因子1是主要的凋亡因子，在哺乳動物細胞線粒體依賴的凋亡途徑中發(fā)揮突出作用，并觸發(fā)胱天蛋白酶9活化。細胞色素C、凋亡酶激活因子1和胱天蛋白酶原9構(gòu)成的復(fù)合體，稱為凋亡復(fù)合體，最終由凋亡復(fù)合體激活胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶7，此時兩條途徑融合匯聚。隨后，胱天蛋白酶3分解聚腺苷二磷酸核糖聚合酶引起DNA斷裂和細胞凋亡[14]?？梢?，細胞凋亡程序無論經(jīng)過胱天蛋白酶8還是胱天蛋白酶9途徑的激活，胱天蛋白酶3都是最后共同通路的關(guān)鍵。

2.1.3胱天蛋白酶3在細胞凋亡中的雙向作用 經(jīng)逐步完善的研究發(fā)現(xiàn)，在一定的情況下，內(nèi)源性和外源性細胞凋亡路徑可相互激活，活化后的胱天蛋白酶9剪切并活化胱天蛋白酶3，然后在反饋回路中可以激活胱天蛋白酶8，進而推測活化形式的胱天蛋白酶3也可能以類似的逆行方式激活胱天蛋白酶9[15]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，胱天蛋白酶3在細胞水平可促進凋亡的發(fā)生，但在實驗動物體內(nèi)可能抑制凋亡，胱天蛋白酶3產(chǎn)生抑制凋亡作用的原因很可能是核酸內(nèi)切酶G的作用，故認為胱天蛋白酶3在細胞凋亡過程中具有雙向調(diào)節(jié)作用[16]。Kroemer等[17]闡明了胱天蛋白酶和細胞凋亡之間的關(guān)系，即胱天蛋白酶激活將引起凋亡的發(fā)生，而細胞凋亡的發(fā)生卻不一定完全是胱天蛋白酶激活所致，所以通過使用小分子抑制劑抑制胱天蛋白酶家族的作用可以減緩但并不能完全阻止細胞凋亡過程[18]。

2.2胱天蛋白酶3與膿毒癥致AKI 由于細胞凋亡在膿毒癥致AKI發(fā)病機制中的關(guān)鍵性作用，胱天蛋白酶3與其相關(guān)研究不斷增多。在許多膿毒癥動物模型中不同部位的器官組織損傷均發(fā)現(xiàn)顯著的胱天蛋白酶3激活增加，Comim等[19]發(fā)現(xiàn)，膿毒癥胱天蛋白酶3是盲腸結(jié)扎穿孔模型動物中海馬組織細胞凋亡的主導(dǎo)因素。Lerolle等[20]對19例膿毒癥患者的腎臟活檢證實了腎小管上皮細胞凋亡的存在，明確了胱天蛋白酶3的關(guān)鍵執(zhí)行作用。Stoyanoff等[21]還發(fā)現(xiàn)，促紅細胞生成素對膿毒癥AKI模型有腎保護作用，主要通過防止線粒體內(nèi)膜的改變和細胞色素C釋放阻斷胱天蛋白酶3的激活和后續(xù)細胞凋亡反應(yīng)過程的發(fā)生，且胱天蛋白酶3活性的檢測也證實膿毒癥致AKI模型的細胞凋亡主要發(fā)生在腎小管細胞中。Lee等[4]通過比較評估膿毒癥致AKI和缺血/再灌注AKI兩種模型小鼠的細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，膿毒癥模型組與假手術(shù)組相比，不僅凋亡細胞增多，腎臟組織中胱天蛋白酶3的活化也明顯增加，且與血肌酐水平和腎功能損害程度呈正相關(guān)，充分證實了胱天蛋白酶3在膿毒癥致AKI中是極為關(guān)鍵的。此外，為了探索胱天蛋白酶3抑制劑對膿毒癥致AKI腎功能的影響，該研究還在盲腸結(jié)扎穿孔造模前給予胱天蛋白酶3抑制劑預(yù)處理治療。研究發(fā)現(xiàn)，胱天蛋白酶3抑制劑預(yù)處理可使腎組織的腎臟細胞或免疫細胞凋亡數(shù)量減少，腎組織的受損程度也顯著減弱?？梢姡I臟細胞和免疫細胞的凋亡是導(dǎo)致膿毒癥期間的腎功能障礙的關(guān)鍵，抑制胱天蛋白酶3可引起細胞凋亡的顯著減少使腎衰竭減輕。由于胱天蛋白酶3的抑制可能與免疫細胞凋亡顯著抑制相關(guān)，因此尚有待進一步的研究明確。

由于缺乏較為敏感的特異性生物標(biāo)志物用來提前判斷腎小管上皮細胞的損傷和凋亡，故臨床上膿毒性AKI患者的病死率較高且預(yù)后較差[22]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥患者的血清中胱天蛋白酶3明顯處于較高水平，乳酸清除率降低的膿毒癥患者72 h內(nèi)血清胱天蛋白酶3同樣較高，且病死率增高[23]。Lorente等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者第1周血清胱天蛋白酶3水平與細胞凋亡、膿毒癥嚴重程度(依據(jù)血清乳酸水平和序貫器官衰竭評分判定)以及膿毒癥病死率之間存在密切關(guān)聯(lián)。因此，嚴重膿毒癥診斷時，血清胱天蛋白酶3水平可作為30 d內(nèi)膿毒癥病死率預(yù)測的生物標(biāo)志物[25]。由此可見，胱天蛋白酶3在調(diào)節(jié)腎臟腎小管上皮細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，且極可能成為一個關(guān)鍵的早期特異性生物標(biāo)志物。Yang等[26]通過使用胱天蛋白酶3剔除小鼠發(fā)現(xiàn)，胱天蛋白酶3缺乏時，AKI小鼠的腎小管缺血程度、微血管損傷程度減輕，間質(zhì)纖維化減少，微血管能夠保持一定的完整性。但是，胱天蛋白酶3在調(diào)節(jié)膿毒癥致AKI不同發(fā)展階段腎小管和相關(guān)微血管損傷方面的相關(guān)重要性還有待觀察。

3 胱天蛋白酶3抑制劑的應(yīng)用

目前，胱天蛋白酶抑制劑治療膿毒癥致AKI的重要性日益突出，其特異性阻斷凋亡途徑的治療作用逐漸被關(guān)注。細胞凋亡作為膿毒癥的主要致病因素，阻斷其凋亡過程成為改善膿毒癥相關(guān)疾病發(fā)展的新靶點。抑制胱天蛋白酶激活是膿毒癥最早的抗凋亡方法之一。胱天蛋白酶抑制劑通常含有氟甲基酮或氯甲基酮，可模擬胱天蛋白酶底物特異性剪切位點的肽衍生物。已知的胱天蛋白酶特異性抑制劑包括胱天蛋白酶抑制劑、胱天蛋白酶3抑制劑、胱天蛋白酶7抑制劑和胱天蛋白酶1抑制劑等[27]。Weber等[28]證實，泛胱天蛋白酶抑制劑可顯著抑制淋巴細胞和內(nèi)皮細胞的凋亡，減少外周血單核細胞IL-1β、IL-18等炎性因子的釋放，提高膿毒癥動物模型的存活率。Hotchkiss等[29]研究發(fā)現(xiàn)，給予膿毒癥大鼠的動物模型胱天蛋白酶抑制劑可明顯降低細胞凋亡程度和病死率，提高40%～45%的膿毒癥大鼠生存，證明選擇性抑制胱天蛋白酶3可明顯減少膿毒癥引起的細胞凋亡，改善膿毒癥患者的存活率，為臨床上開展靶向抑制凋亡途徑治療膿毒癥患者提供支持性證據(jù)。此外，還有研究指出，即使少量胱天蛋白酶3激活，也足以啟動DNA分解過程，并導(dǎo)致凋亡細胞發(fā)生死亡。因此，有必要研究能力更強、效果更完全、能夠發(fā)揮持續(xù)和完全作用的胱天蛋白酶抑制劑[30]。

4 小 結(jié)

胱天蛋白酶3在細胞凋亡中的重要作用已成為人們關(guān)注的焦點。在膿毒癥的動物模型中不同部位的胱天蛋白酶3活性均有所增加，揭示了胱天蛋白酶3在膿毒癥引起的多器官功能障礙中的關(guān)鍵性作用。膿毒癥AKI早期檢測血清胱天蛋白酶3水平有重要的臨床意義，疾病進展過程中細胞凋亡不斷發(fā)生，由于受感染組織器官中存活細胞數(shù)量不斷減少，可能最終引起膿毒癥患者的多器官衰竭和死亡，故抑制胱天蛋白酶3對減輕細胞凋亡的發(fā)生也有一定的作用[31-32]。除液體復(fù)蘇和重癥監(jiān)護形式的抗菌治療和支持治療外，很少有在生物學(xué)上合理、有針對性的方法能夠提高膿毒癥重癥患者的生存率，了解膿毒癥所致AKI中細胞凋亡的重要特定位點，提供針對細胞凋亡的靶向治療，可能有助于開發(fā)膿毒癥和膿毒癥致嚴重AKI的新藥物靶點。也有學(xué)者認為，使用胱天蛋白酶抑制劑足以抑制細胞凋亡的發(fā)生，但同時也可引起其他不依賴胱天蛋白酶的細胞壞死現(xiàn)象的出現(xiàn)[33]。使用胱天蛋白酶抑制劑治療膿毒癥存在潛在缺陷，但針對特定胱天蛋白酶3的臨時抑制治療在膿毒癥AKI的適當(dāng)階段仍可能是最有效的方法[34]。