李鑫峰 周亞濱 王 倩 楊建飛△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院，江蘇 鹽城 224000）

急性冠脈綜合征（ACS）是由冠狀動脈中不穩(wěn)定性的斑塊破裂、糜爛或出血后誘發(fā)冠狀動脈內(nèi)血栓形成，從而引起的一系列急性、重癥心肌缺血綜合征［1］。根據(jù)其臨床類型可分為不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）、非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）和 ST段抬高型心肌梗死（STEMI）。與以往的研究不同，目前認(rèn)為動脈粥樣硬化是一類免疫炎癥性疾病，大量的炎性細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與從脂質(zhì)斑塊到粥樣斑塊的整個過程，而且炎癥反應(yīng)是引起斑塊不穩(wěn)定性的重要因素之一［2］。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，蘇木乙酸乙酯提取液（SAEE）能夠顯著降低大鼠血清單核細(xì)胞趨化蛋白1、重組人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1β及超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）的水平，從而起到抗動脈粥樣硬化的作用［3-5］。同時，SAEE還能夠調(diào)控血清T淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子的水平，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎的作用［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的失衡在動脈粥樣硬化炎癥調(diào)控機制方面發(fā)揮著重要的作用，同時，CD4+CD25+Fox3p+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠通過抑制低密度脂蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞活化，從而改善動脈粥樣硬化［8］。因此，本課題通過檢測外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖，白細(xì)胞介素-17A（IL-17A）、叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子 3（Foxp3）的表達(dá)及Th17/Treg的比值，并以ACS和穩(wěn)定型心絞痛（SAP）作為對照，進一步探討SAEE的抗動脈粥樣硬化的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 1）診斷標(biāo)準(zhǔn)。ACS診斷參照2014年美國心臟協(xié)會和美國心臟病學(xué)會發(fā)布的《非ST段抬高型急性冠脈綜合征患者管理指南》［9］和2012年歐洲心臟病學(xué)會發(fā)布的 《ST段抬高型心肌梗死管理指南》［10］中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和分型標(biāo)準(zhǔn)。SAP診斷參照2007年中華醫(yī)學(xué)會心血管病分會發(fā)布的 《慢性穩(wěn)定型心絞痛診斷與治療指南》［11］。2）納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述標(biāo)準(zhǔn)；經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)；知情同意并簽署知情書。3）排除標(biāo)準(zhǔn)：同時伴有急性期腦卒中的患者；合并嚴(yán)重的肝、腎及惡性腫瘤的患者；妊娠及哺乳期女性患者；近期服用免疫抑制劑或類固醇類藥物者。

1.2 臨床資料 選取筆者所在醫(yī)院心內(nèi)二科2017年1月至2018年3月收治的ACS患者30例 （包括UAP16例，NSTEMI 5例，STEMI 9例），同時選取 10例SAP患者作為陰性對照組。兩組患者臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

1.3 MTT比色法檢測CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖 兩組患者均于禁食12 h后抽取空腹靜脈血9 mL，肝素抗凝，以備檢測。采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，免疫磁珠法分離CD4+T淋巴細(xì)胞，重懸于10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，接種于培養(yǎng)板，設(shè)立SAP組、ACS 組、ACS+SAEE 低劑量組（40 mmol/L）和 ACS+SAEE高劑量組（80 mmol/L）。加入CD3單克隆抗體，培養(yǎng)4 d后，酶標(biāo)儀測定各組在570 nm處的OD值。1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Th17及Treg的表達(dá)采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，用10%小牛血清的1640培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)板，設(shè)立SAP組、ACS組、ACS+SAEE低劑量組（40 mmol/L）和 ACS+SAEE 高劑量組（80 mmol/L）共培養(yǎng)1 h。 37℃、5%CO2孵育6 h，PBS洗滌，加入FITCCD4抗體1 μL避光孵育60 min，加入Foxp3檢測打孔、固定濃縮液1 mL避光孵育1 h。加入IL-17A抗體和Foxp3抗體，流式細(xì)胞儀檢測IL-17A和Foxp3的百分比含量。

1.5 RT-PCR檢測IL-17A mRNA和Foxp3 mRNA的表達(dá) 采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞，用10%小牛血清的1640培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)板，設(shè)立SAP組、ACS組、ACS+SAEE低劑量組（40 mmol/L）和 ACS+SAEE 高劑量組（80 mmol/L）共培養(yǎng)1 h。Trizol一步法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，IL-17A 上游引物：5′-GCCTTCAAGACTGAACACCG-3′。 下游引物：5′-TGACATGCCATTCCTCAGGG-3′。Foxp3 上 游 引 物 ：5′-CAGGAGAAAGCGGATACCA AATG-3′。 下游引物：5′-ATCTGTGAGGACTACCGAG CC-3′。 β-actin 上游引物：5′-TGTGATGGTGGGAATG GGTCAGAA-3′。 下游引物 5′-TGTGGTGCCAGATCTT CTCCATGT-3′。建立qPCR反轉(zhuǎn)錄體系，SYBR Green I熒光染料技術(shù)檢測IL-17A mRNA和Foxp3 mRNA的表達(dá)，以 β-actin 為內(nèi)參，以 2-△△CT計算 IL-17A mRNA和Foxp3 mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析，計數(shù)資料以n表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SAEE對CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖的影響 見表2。 ACS組外周血 CD4+T淋巴細(xì)胞 24、48、72、96 h增殖能力較SAP組顯著增高（P＜0.01）；SAEE能顯著抑制ACS外周血CD4+T淋巴細(xì)胞體外增殖能力（P＜0.05和P＜0.01），其中以SAEE高劑量組對ACS外周血CD4+T淋巴細(xì)胞體外增殖抑制效果最佳。

表2 SAEE對CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖的影響（x±s）

2.2 SAEE對外周血Th17及Treg的表達(dá)的影響 見表3。IL-17A是Th17的代表性炎性因子，而Foxp3是Treg細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，因此本研究中分別以IL-17A和Foxp3代表CD4+T淋巴細(xì)胞中Th17和Treg的水平。本研究結(jié)果顯示，ACS組Th17細(xì)胞百分比較SAP組顯著增高，Treg細(xì)胞百分比顯著降低，Th17/Treg比值顯著增高（P＜0.01）；SAEE低劑量和高劑量均能顯著降低外周血Th17細(xì)胞百分比，升高Treg細(xì)胞百分比，降低Th17/Treg的比值，與ACS組比較，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

組 別 n Th17/CD4+（%） Treg/CD4+（%） Th17/Treg SAP組 10 ACS組 10 ACS+SAEE低劑量組 10 2.45±0.86 5.47±1.78 0.45±0.07 4.09±1.47△△ 3.12±0.97△△ 1.31±0.34△△3.46±1.23** 3.96±1.07** 0.87±0.16**ACS+SAEE高劑量組 102.74±0.91** 4.89±1.52** 0.56±0.13**

2.3 SAEE對IL-17A mRNA和Foxp3 mRNA表達(dá)的影響 見表4。與SAP組比較，ACS組患者IL-17A mRNA表達(dá)顯著增高，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；SAEE低劑量和高劑量均能顯著降低IL-17A mRNA的表達(dá)，升高Foxp3 mRNA的表達(dá)（P＜0.01），其中以SAEE高劑量組效果最佳。

組 別 n IL-17A mRNA Foxp3 mRNA SAP組 10 1.0 1.0 ACS 組 10 2.37±0.89△△ 0.42±0.09△△ACS+SAEE 低劑量組 10 1.76±0.48** 0.69±0.12**ACS+SAEE 高劑量組 10 1.19±0.27** 1.21±0.31**

3 討 論

心血管疾病已成為當(dāng)前全球性的公共衛(wèi)生問題，并且隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢。據(jù)2014年中國心血管病調(diào)查報告顯示，我國約有2.9億心血管疾病的患者，其中心肌梗死患者約為250萬，并且每5例死亡的患者中就有1名心血管疾病患者［12］。作為臨床上最常見的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病類型之一，ACS是一大類包括不同臨床癥狀、預(yù)后和危險因素的臨床綜合征，具有病死率高和致殘率高的特點，嚴(yán)重危害人們的健康和生活質(zhì)量［13］。據(jù)GRACE調(diào)查報告顯示，ACS患者1年死亡率約為15%，而5年死亡率甚至高達(dá)20%［14］。

既往的研究認(rèn)為，進行性增大的粥樣硬化斑塊所導(dǎo)致的冠狀動脈管腔狹窄、阻塞是心肌缺血的常見原因。但是現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明，斑塊破裂、氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、炎癥反應(yīng)、血小板的黏附、聚集和血栓形成是導(dǎo)致ACS的主要病理機制［15］。與穩(wěn)定斑塊不同，不穩(wěn)定斑塊的破裂易發(fā)生于富含炎性因子及細(xì)胞因子的纖維帽邊緣處。在外因的作用下，血流動力學(xué)指標(biāo)發(fā)生改變，纖維帽發(fā)生破裂，脂核溢出，基質(zhì)暴露，內(nèi)皮下黏附分子和血小板發(fā)生聚集形成白色血栓，使管腔狹窄或不完全性閉塞，同時激活的血小板釋放活性物質(zhì)，導(dǎo)致血管收縮，最終導(dǎo)致血流減少或中斷，造成心臟缺血事件的發(fā)生［16］。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)的失調(diào)在穩(wěn)定斑塊到不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。免疫炎癥細(xì)胞（尤其是T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的活化，能夠加速ACS局部、循環(huán)中免疫炎癥反應(yīng)和分泌大量hs-CRP，促使斑塊的穩(wěn)定性的改變甚至破裂［17］。CD4+T淋巴細(xì)胞在ACS炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，有動物研究顯示CD4+T淋巴細(xì)胞能夠加速動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，去除CD4+T淋巴細(xì)胞能夠有效減輕小鼠動脈硬化損傷［18］。本研究結(jié)果顯示，ACS組患者CD4+T淋巴細(xì)胞增殖能力較SAP組顯著增加，而SAEE對ACS患者CD4+T淋巴細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，并且以SAEE高劑量抑制作用最佳。Th17作為效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，能夠通過分泌IL-17及TNF-α等炎性因子，激活病理性免疫炎癥反應(yīng)，而Treg作為一類負(fù)性調(diào)控的免疫細(xì)胞，具有保持免疫耐受、抑制炎癥反應(yīng)和維持免疫狀態(tài)平衡的作用，而Th17/Treg比例的失衡能夠促進斑塊的不穩(wěn)定性和誘導(dǎo)ACS的發(fā)生［19］。本研究結(jié)果顯示，ACS組Th17細(xì)胞百分比較SAP組顯著增高，Treg細(xì)胞百分比顯著降低，Th17/Treg比值顯著增高，這與之前的研究結(jié)果一致［20］。SAEE能夠通過降低外周血Th17細(xì)胞百分比，升高Treg細(xì)胞百分比，降低Th17/Treg的比值，從而調(diào)控ACS患者的免疫炎癥反應(yīng)。IL-17A是新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，能夠加速動脈硬化的發(fā)展，F(xiàn)oxp3是Treg最具有特異性的轉(zhuǎn)錄因子，對Treg細(xì)胞分化、成熟及功能的發(fā)揮具有重要的意義［21］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAEE能夠降低IL-17A mRNA的表達(dá)，升高Foxp3 mRNA的表達(dá)，從而拮抗動脈硬化的發(fā)展。

綜上所述，SAEE能夠通過抑制外周血CD4+T淋巴細(xì)胞增殖，降低IL-17A的表達(dá)，增加Foxp3 mRNA的表達(dá)，調(diào)控Th17/Treg的平衡，從而達(dá)到抑制免疫炎癥反應(yīng)和拮抗動脈硬化的作用。