李 霞, 陳治中, 何松哲, 李 政

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，廣西 桂林 541001； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康臨床醫(yī)學(xué)院，南寧 530011；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，南寧 530021)

免疫治療是當(dāng)前腫瘤免疫學(xué)的研究熱點，可通過識別和抑制腫瘤提高機(jī)體免疫功能，但免疫抑制狀態(tài)的存在成為免疫治療的最大障礙，因此探究免疫抑制的形成機(jī)制及其有效逆轉(zhuǎn)模式是當(dāng)前腫瘤防治有待解決的關(guān)鍵問題[1]。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domain，Tim)-3在免疫細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)，不僅調(diào)控機(jī)體的免疫功能，還參與腫瘤的免疫逃逸和侵襲轉(zhuǎn)移，與腫瘤臨床分期和治療轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，調(diào)控Tim-3相應(yīng)信號通路的生物學(xué)特征有助于激活T細(xì)胞的功能和活性，抑制腫瘤生長[2-3]?，F(xiàn)就Tim-3及其配體的分子特征和功能以及Tim-3介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸和免疫治療的研究進(jìn)展予以綜述，以期為腫瘤免疫靶向治療提供依據(jù)和新的思路。

1 Tim-3的分子特征及其表達(dá)

Tim-3屬于Tim家族中具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白，于2002年首先在活化的輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th細(xì)胞)1中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是Th1細(xì)胞特定表達(dá)的一類抑制性分子[4]。隨后有研究發(fā)現(xiàn)，Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上均可檢測到Tim-3表達(dá)，甚至自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)、肥大細(xì)胞以及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等表面也存在Tim-3的表達(dá)，表明Tim-3不僅參與機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)控，還參與機(jī)體天然免疫反應(yīng)的調(diào)控[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3在多種實體腫瘤細(xì)胞表面也有表達(dá)[2-5]。Tim-3還可以可溶性方式分泌到細(xì)胞外，但其在細(xì)胞外的生物學(xué)功能尚不確定[6]。

人體內(nèi)Tim-3分子是由301個氨基酸構(gòu)成的跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括免疫球蛋白域、細(xì)胞外的糖基黏蛋白、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)的C短尾部(由酪氨酸組成保守信號基序)[2-3]。Tim-3通過細(xì)胞外免疫球蛋白域與其配體相互作用，免疫球蛋白域在二硫鍵作用下，由6個半胱氨酸殘基構(gòu)成一個與配體結(jié)合的“口袋”樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是Tim家族的特征性識別結(jié)構(gòu)[7-8]。Tim-3通過與其配體相互作用誘發(fā)一系列信號傳遞，并與T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)信號鏈相互作用，從而抑制免疫細(xì)胞功能，誘導(dǎo)T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞的凋亡，參與腫瘤免疫抑制、自身免疫性反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、移植排斥反應(yīng)等多種免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。

2 Tim-3配體及其相互作用

Tim-3配體通過與Tim-3免疫球蛋白域的相互作用發(fā)揮生物學(xué)活性功能。Tim-3配體主要有3種，其中研究最早、最主要的Tim-3配體是半乳凝素-9(galectin 9，Gal-9)，之后發(fā)現(xiàn)有高遷移率組蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)和癌胚抗原細(xì)胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule-1，Ceacam-1)[3,10]。Tim-3在外周血和腫瘤微環(huán)境中呈高表達(dá)，通過與配體相互作用轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性信號來調(diào)控免疫功能[11]。然而，Tim-3傳導(dǎo)共刺激信號和發(fā)揮免疫抑制作用是否必須依賴與配體的交聯(lián)、Tim-3與各配體結(jié)合是否具有協(xié)同效應(yīng)和交叉對話等還需要大量試驗研究的闡明。

2.1Gal-9 Gal-9是首個被識別的Tim-3天然配體，屬于S型凝集素，由兩個糖基識別結(jié)構(gòu)域通過一條肽鏈相連而成，是一種廣泛性表達(dá)的可溶性分子，可以不同程度在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、抗原呈遞細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)[12]。糖基化的Tim-3的免疫球蛋白域可與Gal-9相互作用，引起Tim-3胞內(nèi)段結(jié)合的HLA-B關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄因子3(HLA-B associated transcript 3,BAT3)發(fā)生解離，刺激鈣離子進(jìn)入活化的T細(xì)胞內(nèi)，通過誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[13-14]。在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Tim-3和Gal-9表達(dá)下降與促炎細(xì)胞因子[腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β]增加以及抗炎細(xì)胞因子(轉(zhuǎn)化生長因子-β和IL-10)下降相關(guān)；同時還發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞向M1型極化增加，而用Gal-9進(jìn)行重組處理后則出現(xiàn)相反現(xiàn)象，由此推測，Tim-3/Gal-9信號通路可通過調(diào)控細(xì)胞因子分泌和巨噬細(xì)胞極化參與腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移[15]。但其因果關(guān)系仍需通過分別阻斷腫瘤模型的Gal-9和Tim-3并檢測阻斷前后各種細(xì)胞因子的變化水平及其與M1極化的關(guān)系來闡明。

2.2HMGB1 HMGB1是定位于細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白成分，其對腫瘤、感染等損傷性刺激異常敏感，可由活化的DCs釋放，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和感染細(xì)胞等釋放的進(jìn)入細(xì)胞核囊泡的核酸內(nèi)吞，可清除免疫原性物質(zhì)，在抗腫瘤和抗感染免疫中起橋梁作用[16]。與正常組織DCs相比，腫瘤微環(huán)境中浸潤的DCs可高表達(dá)Tim-3，且Tim-3與腫瘤細(xì)胞釋放的核酸性抗原競爭性結(jié)合HMGB1的同一結(jié)構(gòu)域，可阻斷核酸與HMGB1復(fù)合物的形成，抑制HMGB1介導(dǎo)的核酸進(jìn)入核內(nèi)囊泡的固有免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]。因此，可將阻斷Tim-3/HMGB1信號通路(即解除腫瘤微環(huán)境中DCs對腫瘤釋放核酸所激發(fā)免疫反應(yīng)的抑制作用)作為開發(fā)預(yù)防腫瘤DNA疫苗和腫瘤化療的理論依據(jù)。一項對白血病的研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3/HMGB1通路可通過影響腫瘤壞死因子-α和IL-1β的分泌促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞的免疫逃逸[18]。

2.3Ceacam-1 Ceacam-1廣泛分布于免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上，可以跨膜形式存在于細(xì)胞上，也可以分泌形式存在于體液中，通過細(xì)胞間黏附作用轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡，并可參與管腔結(jié)構(gòu)形成以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[2-3]。Ceacam-1可以與糖基化Tim-3免疫球蛋白域的FG-CC環(huán)結(jié)合，以傳遞免疫抑制信號和誘導(dǎo)免疫耐受[2-3]。Tim-3/Ceacam-1的相互作用可產(chǎn)生與Tim-3/Gal-9通路類似的效應(yīng)，也可引起Tim-3胞內(nèi)段結(jié)合的BAT3發(fā)生解離，刺激鈣離子進(jìn)入活化的T細(xì)胞內(nèi)而誘發(fā)凋亡[13]，可見，Tim-3/Ceacam-1和Tim-3/Gal-9信號通路可能存在協(xié)同效應(yīng)。Tim-3上HMGB1結(jié)合域與Ceacam-1結(jié)合域的結(jié)構(gòu)存在重疊，Tim-3配體結(jié)構(gòu)域“FG-CC環(huán)”中的Q62 (人類是E62)是Tim-3與HMGB1和Ceacam-1相互作用的必需氨基酸殘基[13,19]。目前，Tim-3與配體HMGB1和Ceacam-1之間是否存在競爭性結(jié)合及交叉對話尚不清楚，表明HMGB1和Ceacam1介導(dǎo)的Tim-3信號通路的細(xì)胞類型特異性尚有待進(jìn)一步研究的確認(rèn)。對結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等實體腫瘤研究證實，Ceacam-1和Tim-3單克隆抗體聯(lián)合阻滯可有效增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答[19-20]。

3 Tim-3與免疫細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫耐受

Tim-3與其配體相互作用后可傳遞抑制信號，發(fā)揮抑制免疫細(xì)胞功能、減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生、抑制免疫細(xì)胞增殖的作用，然而通過Tim-3單克隆抗體尤其是聯(lián)合使用程序性細(xì)胞死亡受體-1(programmed cell death-1，PD-1)單克隆抗體阻斷其相互作用可增加細(xì)胞因子產(chǎn)生、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制腫瘤生長[13,21]。但對感染結(jié)核小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3可傳遞相反信號而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的抗感染免疫，并在Gal-9陰性巨噬細(xì)胞上喪失此功能[22]。目前，Tim-3免疫抑制作用的機(jī)制尚不明確?，F(xiàn)對T細(xì)胞、NK細(xì)胞、TAMs及髓源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)與Tim-3的可能腫瘤免疫耐受和逃逸機(jī)制予以闡述。

3.1Tim-3與T細(xì)胞 T細(xì)胞可在局部微環(huán)境和體液因子等的調(diào)控下分化為成熟免疫細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)控機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫[23]。Tim-3信號通路及其與TCR信號的耦合機(jī)制對T細(xì)胞功能的影響還有待探索，尚無統(tǒng)一定論。動物實驗研究認(rèn)為，Tim-3與Gal-9等配體結(jié)合可使結(jié)合在Tim-3細(xì)胞尾部的BAT3解離，TCR信號和CD28共刺激信號可激活非受體酪氨酸激酶Src家族成員Lck和Fyn信號分子，促進(jìn)Tim-3胞內(nèi)保守絡(luò)氨酸殘基(鼠類Y256和Y263位點，人類Y265和Y272位點)的磷酸化，進(jìn)而招募P85接頭蛋白來促進(jìn)磷脂酰肌醇-3-激酶的活化，從而促進(jìn)Tim-3+T淋巴細(xì)胞的增殖和活化[2-3,24]。對Jurkat細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3+Jurkat細(xì)胞與Gal-9相互作用可抑制TCR信號介導(dǎo)的活化T細(xì)胞核因子和核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)的活化，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的活性[2-3]。將經(jīng)CD3/CD28激活的人外周血單個核細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的PD-1和Tim-3表達(dá)增加，NF-κB磷酸化水平、細(xì)胞增殖能力、γ干擾素的產(chǎn)生均降低，細(xì)胞凋亡增加；而經(jīng)抗程序性細(xì)胞死亡配體-1和Gal-9單克隆抗體阻斷后，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的NF-κB磷酸化、細(xì)胞增殖能力、γ干擾素產(chǎn)生均恢復(fù)，且細(xì)胞凋亡降低，證實Tim-3/Gal-9可通過調(diào)控NF-κB的活化來調(diào)控T細(xì)胞的功能和活性[25]，但該實驗并未研究分別阻斷PD-L1/Gal-9/NF-κB、Tim-3/Gal-9/NF-κB以及TCR信號通路對細(xì)胞凋亡的影響。

Tim-3相關(guān)信號通路對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)可能受到免疫細(xì)胞種類及其活化狀態(tài)的影響。肺細(xì)胞癌患者T細(xì)胞高表達(dá)Tim-3與T細(xì)胞耗竭有關(guān)，抗體阻斷Tim-3/Gal-9信號通路后可逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭狀態(tài)[5,26]。與單獨(dú)應(yīng)用Tim-3或PD-1單克隆抗體相比，Tim-3與PD-1單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤作用以及對T細(xì)胞功能恢復(fù)的作用明顯增強(qiáng)，可能與腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞共表達(dá)PD-1、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、Tim-3等抑制分子，且其聯(lián)合阻斷可有效恢復(fù)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能有關(guān)[21,27]。

3.2Tim-3與NK細(xì)胞 腫瘤患者外周血和腫瘤微環(huán)境浸潤的NK細(xì)胞高表達(dá)Tim-3，幾乎所有的成熟CD56dimCD16+NK細(xì)胞均表達(dá)Tim-3，細(xì)胞因子IL-12、IL-15和(或)IL-18可誘導(dǎo)未成熟的CD56brightCD16-NK表達(dá)Tim-3，在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中，NK細(xì)胞表達(dá)Tim-3的比例最高，故認(rèn)為Tim-3是NK細(xì)胞成熟和活化的標(biāo)識[2]。NK細(xì)胞中的Tim-3與Gal-9結(jié)合后，胞內(nèi)酪氨酸殘基尾部發(fā)生磷酸化，BAT3發(fā)生解離，可招募Src激酶成員Fyn到胞內(nèi)同一結(jié)合位點，從而抑制Fyn信號對細(xì)胞增殖和活化的刺激，導(dǎo)致NK細(xì)胞耗竭[27]。但目前Tim-3對NK細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用仍存在爭議。阻斷感染乙型肝炎病毒等慢性感染者的Tim-3，NK細(xì)胞毒性和γ干擾素的分泌能力增強(qiáng)[28]。Tim-3在黑色素瘤患者NK細(xì)胞中的表達(dá)也增加，但采用單克隆抗體阻斷Tim-3后，NK細(xì)胞呈耗竭狀態(tài)，且分泌γ干擾素的能力降低[29]。因此，NK細(xì)胞上Tim-3的功能尚有待進(jìn)一步研究。

3.3Tim-3與TAMs 腫瘤微環(huán)境中可見大量的Tim-3+TAMs浸潤，TAMs的浸潤程度、極化狀態(tài)以及Tim-3的表達(dá)量均與腫瘤的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[30-31]。TAMs衍生的IL-6可活化JAK激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)3信號，活化的STAT3轉(zhuǎn)錄抑制腫瘤抑制因子miR-506-3p(調(diào)控FoxQ1的關(guān)鍵微RNA)，導(dǎo)致FoxQ1表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)募集巨噬細(xì)胞的趨化因子(如CC趨化因子配體2)增加，使更多TAMs聚集在腫瘤微環(huán)境中，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，通過阻斷CC趨化因子配體2或IL-6可破壞以上惡性循環(huán)，減少巨噬細(xì)胞聚集[32]?？梢姡[瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的STAT3/miR-506-3p/FoxQ1/CC趨化因子配體2信號軸有望成為腫瘤治療及其免疫調(diào)控的關(guān)鍵靶標(biāo)。

3.4Tim-3與MDSCs 在腫瘤微環(huán)境中，MDSCs產(chǎn)生的精氨酸酶1、一氧化氮合酶和活性氧類等有顯著的免疫抑制作用，并與腫瘤發(fā)展和患者預(yù)后密切相關(guān)[33]。對胃癌患者的研究證實，MDSCs上Tim-3的表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移及其臨床分期相關(guān)[34]。T細(xì)胞上Tim-3基因受CD2啟動子的驅(qū)動而呈過表達(dá)，可進(jìn)一步誘導(dǎo)粒細(xì)胞樣MDSCs的產(chǎn)生，并參與腫瘤預(yù)后和轉(zhuǎn)歸[35]。對白血病的研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞表達(dá)的Tim-3可誘導(dǎo)MDSCs擴(kuò)增，促進(jìn)MDSCs分化為TAMs，而TAMs可通過細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、血管生成和淋巴管生成來促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的增殖和存活?？梢?，在腫瘤微環(huán)境中，Tim-3可通過與TAMs和MDSCs協(xié)同作用介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸[36]。

4 Tim-3介導(dǎo)腫瘤免疫治療及其機(jī)制

免疫檢查點分子(如PD-1、CTLA-4和Tim-3)在腫瘤患者外周血單個核細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞中的表達(dá)增多，其與相應(yīng)配體結(jié)合后，通過Fyn/p85/磷脂酰肌醇-3-激酶等信號通路抑制免疫細(xì)胞功能，促進(jìn)腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移，應(yīng)用單克隆抗體阻斷免疫檢查點分子與其配體相應(yīng)信號通路后，可逆轉(zhuǎn)免疫細(xì)胞的耗竭，抑制腫瘤發(fā)展，為腫瘤治療中檢查點的阻斷提供依據(jù)[2-3,13,37-38]。

2011年，Ipilimumab作為抗CTLA-4免疫治療藥物被批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療，但其治療有效率較低[2-3]。隨后，美國食品藥品管理局批準(zhǔn)抗PD-1藥物Pembrolizumab用于黑色素瘤和頭頸鱗狀細(xì)胞癌的治療。Nivolumab是美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的第二種抗PD-1單克隆抗體，其對多種惡性腫瘤(非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤和腎細(xì)胞癌等)均具有治療作用，可使部分患者的腫瘤細(xì)胞呈迅速持久地消退。研究表明，Nivolumab和Ipilimumab聯(lián)合使用可顯著提高對惡性腫瘤的治療效果，與單獨(dú)使用Ipilimumab或Nivolumab相比，可顯著延長患者生存時間[13]。但需要重視因免疫治療導(dǎo)致的細(xì)胞毒性反應(yīng)等不良反應(yīng)，且抗PD-1和抗CTLA-4聯(lián)合治療僅對約50%的黑色素瘤患者有顯著療效，有些腫瘤患者對以上兩個檢查點阻斷治療均無反應(yīng)[2-3]。

鑒于Tim-3在免疫細(xì)胞上的選擇性表達(dá)及其結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性，可以通過靶向治療提高其治療精確性并降低其非特異性細(xì)胞毒性反應(yīng)。此外，Tim-3下游信號通路的抑制機(jī)制較明確，與CTLA-4和PD-1下游信號通路存在較大差異[2-3,32]。由此可見，Tim-3獨(dú)特的表達(dá)及其細(xì)胞內(nèi)信號通路對靶向Tim-3的腫瘤免疫治療具有很大的應(yīng)用潛力。

5 展 望

目前，基于免疫檢查點分子和腫瘤免疫的研究已經(jīng)得到了大量的信息和數(shù)據(jù)，且正在進(jìn)行腫瘤免疫治療方案的合理組合和嘗試，并取得了一定成果。在腫瘤免疫中，一些新型免疫抑制性共刺激分子(如淋巴細(xì)胞活化基因3、T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白、B和T淋巴細(xì)胞弱化因子等)的作用及機(jī)制尚不明確，其與Tim-3等分子的關(guān)系還需要進(jìn)一步闡明[38]。此外，Tim-3及其配體信號通路結(jié)構(gòu)和功能以及與淋巴細(xì)胞活化信號通路的交叉對話等問題尚未完全闡明，且尚缺乏聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子等生物學(xué)活性因子治療方案的相關(guān)動物實驗和臨床試驗研究，阻斷抗Tim-3單克隆抗體的結(jié)局亦存在不確定性，因此，還需要大量的實驗研究以優(yōu)化相關(guān)腫瘤免疫治療。