楊 丹，孫慧林，胡 喆，唐 靖

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，廣東 湛江524000)

當(dāng)機體受到細菌、病毒或創(chuàng)傷刺激等外源性病原相關(guān)分子模式或機體受損時釋放的損傷相關(guān)分子模式(damage-related molecular patterns，DAMPs)刺激時，可通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)等模式識別受體，誘導(dǎo)自身免疫或免疫耐受。TLRs家族是一種系統(tǒng)遺傳保守的天然免疫介質(zhì)，對微生物的識別至關(guān)重要，哺乳動物TLRs是一個具有豐富的細胞外亮氨酸重復(fù)序列和胞質(zhì)Toll/白細胞介素(interleukin，IL)-1受體同源域的大家族[1]。TLR9是TLRs家族中的一員，是一種內(nèi)體DNA識別受體，主要在骨髓細胞中表達，并被微生物病原體相關(guān)分子模式和哺乳動物DAMPs激活[2]。人類線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是一個16 569 kb的環(huán)狀DNA，編碼rRNA和tRNA以及13個呼吸鏈亞基，包含一個非編碼環(huán)，含大量非甲基化的二核苷酸片段，稱為CpG島[3]。mtDNA與細菌DNA同源，與細菌DNA相似，均具有大量未甲基化的CpG DNA序列，可引起與細菌感染相似的炎癥反應(yīng)[4]。研究表明，mtDNA作為一種DAMPs，不僅促進抗菌免疫和調(diào)節(jié)抗病毒信號，還有助于細胞損傷和應(yīng)激后的炎癥性疾病[5]?，F(xiàn)就mtDNA-TLR9通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)予以綜述。

1 mtDNA釋放的機制

鈣離子吸收可以引起線粒體形態(tài)和功能活動的劇烈變化，通過線粒體內(nèi)膜開放的非特異性孔隙(即線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔)引起mtDNA釋放[6]。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔是由位于線粒體內(nèi)外膜接觸點的幾種蛋白結(jié)合而成。線粒體既是氧化劑的主要來源，也是氧化劑破壞作用的靶點，在受到DAMPs刺激時，活性氧類(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增加，使線粒體膜電位降低，導(dǎo)致膜完整性受損，mtDNA產(chǎn)生增加，釋放到胞質(zhì)及細胞外[7]。由于mtDNA缺乏組蛋白的保護，并接近電子傳遞鏈，很容易受到ROS的攻擊。Mito-TEMPO(mitochondria-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy)(是一種線粒體靶向抗氧化劑，具有超氧化物和烷基自由基清除能力)通過清除ROS減少mtDNA的釋放和對組織的損傷。環(huán)孢霉素A是線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔抑制物，可通過阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的誘導(dǎo)和線粒體DNA片段的釋放，阻止下游的炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；還有研究表明，在膿毒癥及其他炎性條件下，血小板通過釋放促炎性囊泡等微顆粒，也會導(dǎo)致mtDNA增多[8]。血小板在激活時也會分泌線粒體，線粒體膜磷脂進入細胞外后，可被血清分泌的磷脂酶A2-Ⅱa水解，引起mtDNA的釋放；另外，細胞的壞死性凋亡也會引起mtDNA的釋放，在一項小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，輸血可導(dǎo)致細胞外的mtDNA釋放增加，并引起血管內(nèi)皮細胞的壞死性凋亡[9]。

2 線粒體DNA引起TLR9激活的髓樣分化蛋白88依賴的信號通路

2.1mtDNA-TLR9-髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88，MyD88)-促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK) 當(dāng)機體受到損傷性刺激和病毒細菌感染性刺激時，線粒體損傷釋放出的mtDNA可通過TLR9激活人多形核中性粒細胞和巨噬細胞等免疫細胞，并通過招募MyD88，促進這些免疫細胞的p38 MAPK磷酸化，引起IL-8的分泌和中性粒細胞的趨化作用，從而發(fā)揮機體的抗炎作用，減輕組織損傷，這與脂多糖刺激TLR4配體激活有協(xié)同作用，均是通過MyD88依賴的信號通路，激活下游的MAPK，繼而引起一系列炎性因子的釋放，發(fā)揮先天免疫調(diào)節(jié)作用[10-11]。創(chuàng)傷或失血性休克也可導(dǎo)致mtDNA釋放且進入循環(huán)系統(tǒng)，并通過TLR9激活人多形核中性粒細胞p38 MAPK，使腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-6等炎性因子釋放增加，提示mtDNA在休克后可能作為危險相關(guān)的分子模式或警報蛋白，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征及器官損傷的發(fā)生[12]。

2.2mtDNA-TLR9-MyD88-核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB) mtDNA激活TLR9引發(fā)炎癥反應(yīng)的另一條通路是招募MyD88引起NF-κB激活并觸發(fā)先天免疫應(yīng)答。在急性心肌梗死導(dǎo)致的無菌性炎癥中，循環(huán)中的mtDNA釋放增加，通過激活TLR9受體，激活NF-κB，導(dǎo)致心肌細胞損傷[13]；脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥所致的肺損傷中，mtDNA釋放增加，通過調(diào)節(jié)TLR9識別 MyD88/NF-κB通路可以放大細菌感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征[14]。因此，探討阻斷mtDNA在膿毒癥肺部炎癥放大的有效途徑是膿毒癥致肺損傷治療的另一個關(guān)鍵。有研究表明，慢性心力衰竭與血漿或血清中的促炎因子表達增高密切相關(guān)，患者血漿來源外泌體中的mtDNA增加，mtDNA通過TLR9激活NF-κB，引發(fā)炎癥反應(yīng)，TLR9抑制劑氯喹可以阻斷這種作用[15]。Foley導(dǎo)管損傷膀胱導(dǎo)致mtDNA釋放，中性粒細胞向膀胱腔遷移，引起TLR9和NF-κB激活，mtDNA/TLR9/NF-κB炎癥軸的改善可能作為預(yù)防炎癥和膀胱組織損傷的治療靶點[16]。這種新的炎癥通路可以為包括慢性心力衰竭在內(nèi)的多種炎性疾病的治療提供一種可靠的途徑。

2.3mtDNA-TLR9-MyD88-干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon-regulatory factor，IRF)7 mtDNA還可通過激活TLR9招募MyD88與轉(zhuǎn)錄因子IRF-7誘發(fā)干擾素(interferon，IFN)的釋放。研究表明，氧化的mtDNA類核苷酸從狼瘡中性粒細胞中釋放，觸發(fā)Ⅰ型IFN反應(yīng)[17]。TLR9的激活導(dǎo)致MyD88受體蛋白對Ⅰ型IFN的強烈誘導(dǎo)，IRF-7與MyD88相互作用，在細胞質(zhì)中形成復(fù)合物，該復(fù)合物還涉及IL受體相關(guān)激酶-4和受體相關(guān)因子6，并為IFN基因的TLR9依賴性激活提供了基礎(chǔ)[18]。

2.4其他 mtDNA含有大量未甲基化的CpG DNA序列。用含有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸刺激IRF-5基因敲除鼠的樹突狀細胞，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6、IL-1的產(chǎn)生顯著減少，證實IRF-5參與TLR9-MyD88 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)促炎細胞因子TNF-α、IL-6和IL-12基因轉(zhuǎn)錄[19]。有研究表明，表皮生長因子受體(一種膜結(jié)合蛋白酪氨酸激酶)是TLR9信號的關(guān)鍵，表皮生長因子受體本質(zhì)上與TLR9結(jié)合，在配體的刺激下，介導(dǎo)TLR9酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致MyD88的招募、信號激酶和轉(zhuǎn)錄因子的激活以及基因誘導(dǎo)[2]。這些均很好地闡明了創(chuàng)傷刺激或病原體刺激導(dǎo)致的mtDNA釋放激活TLR9誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的分子機制。

3 mtDNA-TLR9通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

3.1mtDNA-TLR9通路與各疾病中的炎癥反應(yīng) 在機體受到DAMPs和外源性病原相關(guān)分子模式刺激時，引起線粒體膜電位的轉(zhuǎn)移和ROS的生成，使mtDNA釋放到胞質(zhì)中；胞質(zhì)mtDNA可以激活TLR9先天免疫反應(yīng)等，分泌IL-1β、TNF-α和促炎基因表達，也可通過壞死介導(dǎo)的程序性細胞死亡而分泌到細胞外空間；細胞外mtDNA可刺激免疫細胞和上皮細胞，促進組織損傷和全身炎癥反應(yīng)[7]。在未受刺激的細胞中，TLR9位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在mtDNA的刺激下，TLR9轉(zhuǎn)移到核內(nèi)體的膜上，在膜上識別配體并激活細胞[20]。有研究表明，陽離子納米載體誘導(dǎo)的細胞壞死和mtDNA的泄漏可在體內(nèi)引發(fā)嚴(yán)重炎癥，炎癥由TLR9和MyD88信號通路介導(dǎo)；mtDNA觸發(fā)中性粒細胞活化，用活化的TLR9拮抗劑寡聚脫氧核苷酸2088預(yù)處理中性粒細胞，可以抑制mtDNA誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶8釋放和p38 MAPK活化[21-22]，說明mtDNA可以通過TLR9-MyD88通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

3.1.1心腦血管疾病 在臨床中，慢性心力衰竭、動脈粥樣硬化、急性心肌梗死和急性缺血性腦卒中等心血管疾病都會因無菌性炎癥引發(fā)組織損傷。有研究表明，急性心肌梗死可以引起無菌性炎癥，加重組織損傷，導(dǎo)致循環(huán)mtDNA水平升高，而mtDNA通過TLR9和NF-κB激活觸發(fā)先天免疫應(yīng)答，導(dǎo)致心肌細胞損傷[13]。在動脈粥樣硬化疾病中，釋放的mtDNA通過與人抗菌肽LL-37形成復(fù)合物，對脫氧核糖核酸酶Ⅱ降解具有抗性，并逃脫自噬識別，導(dǎo)致TLR9介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)激活，致TLR9的持續(xù)活化，引起自身免疫激活和趨化因子或細胞因子的產(chǎn)生，最終加重動脈粥樣硬化病變，這些數(shù)據(jù)為動脈粥樣硬化伴發(fā)慢性炎癥的發(fā)生機制提供了新的視角，可能提供了一個有前途的新的治療靶點[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，急性缺血性腦卒中患者mtDNA水平增高，而急性缺血性腦卒中患者循環(huán)mtDNA水平與分離的單核細胞炎癥反應(yīng)受損有關(guān)，該研究根據(jù)循環(huán)mtDNA水平將急性缺血性腦卒中患者分為感染組和未感染組，在患者血清和mtDNA存在的情況下培養(yǎng)，在內(nèi)毒素攻擊后再現(xiàn)難治性狀態(tài)，而且TLR9拮抗劑或脫氧核糖核酸酶治療均可抵消此內(nèi)毒素感染[24]。因此，mtDNA可以作為卒中相關(guān)感染的一種新的生物標(biāo)志物，成為預(yù)防卒中后感染的臨床靶點[25]。還有研究表明，與健康對照組相比，慢性心力衰竭患者血漿來源外泌體中的mtDNA增加，mtDNA通過TLR9-NF-κB途徑引發(fā)炎癥反應(yīng)，而TLR9抑制劑氯喹可以阻斷這種作用，這些發(fā)現(xiàn)揭示了外泌體誘導(dǎo)炎癥的新機制，為慢性心力衰竭等炎癥相關(guān)疾病的干預(yù)和治療提供了新的視角[15]。急性心肌梗死釋放到循環(huán)中的mtDNA可能通過TLR9-p38 MAPK通路加重缺血再灌注損傷，從而對心肌產(chǎn)生不利影響[26]。由此推測，mtDNA釋放增加激活TLR9，可能是炎癥相關(guān)疾病的另一個分子靶標(biāo)，抑制TLR9的激活，可能減輕機體的炎癥反應(yīng)和組織損傷。

3.1.2膿毒癥 線粒體功能障礙與嚴(yán)重膿毒癥所致的死亡密切相關(guān)。膿毒癥引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征進而導(dǎo)致多器官損傷。有臨床研究表明，危重監(jiān)護病房的患者mtDNA的循環(huán)水平可以預(yù)測危重患者的病死率，且這種相關(guān)性在TLR9表達升高的患者中尤其明顯[27]。脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷和全身炎癥會引起mtDNA的釋放增加，特異性TLR9抑制劑寡聚脫氧核苷酸2088預(yù)處理可顯著減輕mtDNA誘導(dǎo)的急性肺損傷和全身炎癥反應(yīng)，說明mtDNA通過調(diào)節(jié)TLR9識別MyD88/NF-κB通路可能會引發(fā)膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷[14]。在小鼠模型中，單次mtDNA注射對野生型而非TLR9敲除小鼠的適應(yīng)性T細胞毒性造成了嚴(yán)重的TLR9依賴性免疫抑制，并引發(fā)多種免疫抑制機制(包括脾臟微結(jié)構(gòu)的破壞、交叉呈遞樹突狀細胞的缺失)，說明mtDNA是一種內(nèi)源性危險相關(guān)分子模式，是迄今為止未知的膿毒性免疫麻痹誘導(dǎo)因子，是危重患者早期炎癥和隨后免疫抑制之間的可能聯(lián)系，mtDNA不僅可以通過TLR9引起炎癥，介導(dǎo)免疫反應(yīng)，還可能引起免疫抑制，但具體機制還需進一步探索[28]。

3.1.3缺血性疾病 缺血再灌注損傷是一個具有挑戰(zhàn)性的臨床問題，尤其是涉及胃腸道的損傷。mtDNA在細胞死亡和應(yīng)激時釋放，可引起炎癥反應(yīng)，mtDNA在小鼠腸道缺血再灌注模型中也被釋放，與假手術(shù)組相比，mtDNA與炎癥細胞因子分泌增加和腸道屏障損傷增加有關(guān)，說明mtDNA參與缺血再灌注損傷，可能作為腸缺血再灌注的生物標(biāo)志物[29]。mtDNA也是炎癥性腸病激活過程中釋放的一種促炎損傷相關(guān)分子[30]。mtDNA在缺血性疾病中釋放增多，并通過TLR9引發(fā)炎癥反應(yīng)，這可能為缺血性疾病治療提供新的靶點。

3.1.4肝臟疾病 有研究證明，非酒精性脂肪性肝炎患者血漿中含有高水平的mtDNA，具有激活TLR9的能力；大部分血漿mtDNA包含在肝細胞來源的微粒中，從血漿中去除這些微粒后，TLR9的活化能力顯著降低；臨床上應(yīng)用的TLR9拮抗劑在預(yù)防和治療作用下阻斷非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)展；這些數(shù)據(jù)表明，TLR9通路的激活提供了非酒精性脂肪性肝炎關(guān)鍵代謝與炎癥表型之間的聯(lián)系[31]。mtDNA-TLR9介導(dǎo)的炎性通路還可與其他微RNA或長鏈非編碼RNA等其他小分子RNA相互作用，共同調(diào)節(jié)炎癥及免疫反應(yīng)或其他一些作用。在對乙酰氨基酚引起肝毒性的研究中，肝mtDNA/TLR9/miR-223形成負反饋環(huán)，限制小鼠中性粒細胞過度活化和對乙酰氨基酚肝毒性，miR-223的上調(diào)在終止急性中性粒細胞反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，證明是乙酰氨基酚肝衰竭的治療靶點；在沒有脫氧核糖核酸酶Ⅱ的情況下，對肝細胞的凋亡刺激誘導(dǎo)TLR9依賴性IFN-β產(chǎn)生和源自mtDNA的受體相互作用蛋白依賴性非凋亡性細胞死亡[32]。在對乙酰氨基酚導(dǎo)致的肝損傷中，趨化因子和線粒體產(chǎn)物釋放增多，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，而TLR9缺失可阻止炎癥和肺損傷的發(fā)生[33]。

3.1.5其他疾病 ①糖尿病：人們普遍認為糖尿病前期患者處于與內(nèi)皮細胞和線粒體功能障礙相關(guān)的促炎狀態(tài)，循環(huán)mtDNA水平的升高通過激活內(nèi)皮中存在的TLR9，在糖尿病前期和老年糖尿病患者中均是早期內(nèi)皮功能障礙的觸發(fā)因素[34]。通過抑制mtDNA的釋放可以適當(dāng)改善糖尿病患者的功能狀態(tài)，提供一定的保護機制。②腎臟疾?。篢LR9可能利用內(nèi)源性mtDNA作為配體促進足細胞凋亡，這是腎小球疾病足細胞損傷的一種新機制[35]。③肺炎：有研究表明，紅細胞在正常情況下與mtDNA穩(wěn)態(tài)結(jié)合，在發(fā)生系統(tǒng)性炎癥后mtDNA表達上升，紅細胞表達TLR9，并通過TLR9與mtDNA結(jié)合，可以清除肺損傷后包含CpG序列的脫細胞的mtDNA，在體內(nèi)TLR9依賴紅細胞介導(dǎo)的mtDNA清除的缺失增加了肺損傷；紅細胞介導(dǎo)的mtDNA清除是減輕mtDNA后肺損傷的關(guān)鍵，在疾病狀態(tài)下(如膿毒癥和創(chuàng)傷)，當(dāng)mtDNA升高時，紅細胞在調(diào)節(jié)肺部炎癥中發(fā)揮作用，這也可為肺部炎癥的治療提供一些思路[36]。

3.2mtDNA-TLR9通路與癌癥 炎癥介質(zhì)和細胞效應(yīng)因子是腫瘤局部環(huán)境的重要組成部分。在某些類型的癌癥中，在發(fā)生惡性變化前會出現(xiàn)炎癥。相反，在其他類型的癌癥中，致癌變化會誘導(dǎo)炎癥微環(huán)境，從而促進腫瘤的發(fā)展。潛在的感染和炎癥反應(yīng)與全球15%～20%的癌癥死亡有關(guān)，缺氧誘導(dǎo)細胞內(nèi)易位和釋放多種DAMPs(如高遷移率族蛋白和mtDNA)，這些DAMPs的分子與其受體相互作用，觸發(fā)促炎信號級聯(lián)反應(yīng)，促進腫瘤進展；研究表明，高遷移率族蛋白結(jié)合了缺氧腫瘤細胞胞質(zhì)中的mtDNA，通過激活TLR9信號通路導(dǎo)致炎癥和致瘤信號通路的觸發(fā)，進而導(dǎo)致小鼠體外腫瘤增殖增加和腫瘤生長加快，mtDNA突變和mtDNA拷貝都與癌癥的發(fā)展和進展有關(guān)；此外，mtDNA可通過TLR9刺激急性創(chuàng)傷和損傷后的炎癥反應(yīng)進入血漿，開發(fā)新的癌癥治療策略需要更深入地了解在缺氧環(huán)境下癌細胞、免疫細胞、DAMPs和TLRs之間復(fù)雜的相互作用[37]。自1973年以來，mtDNA已被認為有致癌作用，如原發(fā)性乳腺癌中mtDNA-非編碼循環(huán)的缺失和插入[38]；另外，異常的mtDNA拷貝數(shù)與肺癌有高度的劑量依賴性[39]。在臨床樣本中檢測mtDNA可能是一種有前景的癌癥診斷方法，TLR9和mtDNA在肺癌進展和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮一定的作用[40]。在其他的癌癥疾病中，mtDNA是否釋放增多，是否通過TLR9通路或其他信號通路介導(dǎo)腫瘤的轉(zhuǎn)移還有待于進一步研究。

3.3mtDNA-TLR9通路與病毒 線粒體是免疫系統(tǒng)的中心參與者，mtDNA應(yīng)激是抗病毒信號的細胞內(nèi)在觸發(fā)器，細胞對mtDNA穩(wěn)態(tài)的監(jiān)測與典型的病毒敏感機制合作，充分參與抗病毒的先天免疫[41]。有研究表明，登革病毒感染誘導(dǎo)mtDNA釋放到細胞溶膠中，激活TLR9信號通路，導(dǎo)致IFN產(chǎn)生，登革病毒誘導(dǎo)的mtDNA釋放涉及ROS的生成和炎性小體的激活[42]。已有的研究報道均是mtDNA通過線粒體轉(zhuǎn)錄因子A使得小鼠mtDNA釋放，激活STING(stimulator of interferon genes)-IRF-IFN1信號通路，然后上調(diào)IFN激活基因和IFN的表達，從而發(fā)揮抗病毒的效應(yīng)[41]。這是mtDNA在宿主中發(fā)揮抗病毒免疫的機制。

4 小 結(jié)

mtDNA介導(dǎo)的TLR9炎癥通路在越來越多的疾病中發(fā)揮重要作用，且還有各種相關(guān)的基因參與其中，這可以為疾病治療提供新的靶點和方向，例如可以通過減少mtDNA的釋放，增加mtDNA的清除，以及使用TLR9的拮抗劑來阻斷下游的炎癥反應(yīng)。mtDNA通過TLR9激活免疫系統(tǒng)的機制已經(jīng)為人們所了解，但線粒體釋放mtDNA過程中存在的機制，mtDNA識別TLR9受體的具體機制，激活MAPK或更多信號通路的機制以及是否與其他的信號通路有交叉調(diào)節(jié)等均需進一步探索。未來如何將這種TLR9介導(dǎo)的免疫反應(yīng)機制運用到臨床，治療各種癌癥和炎性疾病還需要進一步研究。