何 鵬，武振方綜述，劉曉偉，許 斌審校

0 引 言

環(huán)狀RNAs（circular RNAs，circRNAs）是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性特殊非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）［1］。早在1976年Sanger等［2］在研究類病毒RNA時(shí)首次在電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)證實(shí)了circRNA存在，與常規(guī)病毒結(jié)構(gòu)不同，其是一種無(wú)蛋白質(zhì)外殼包裹的單鏈閉合的RNA分子，然而限于當(dāng)時(shí)的檢測(cè)方法及研究技術(shù)，發(fā)現(xiàn)初期并未引起人們的重視［3-4］。但隨著高通量測(cè)序技術(shù)及生物信息技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛應(yīng)用，學(xué)者們預(yù)測(cè)人體內(nèi)至少存在約20 000種circRNAs，其數(shù)量超過相應(yīng)線性RNA的10倍［3-5］。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)circRNAs可特異性結(jié)合微小RNA（micro RNA，miRNA），通過其分子海綿機(jī)制參與調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，也可與RNA結(jié)合蛋白（RNA bindingproteins，RBPs）結(jié)合或直接翻譯表達(dá)蛋白質(zhì)在眾多疾病中發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用［6-11］。此外，越來越多的研究證實(shí)circRNAs在腫瘤（如鼻咽癌［7］、肺癌［12］、胃癌［13］、骨肉瘤［14］等）、心血管系統(tǒng)疾病［6］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?5］以及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾?。ü顷P(guān)節(jié)炎［16］、腰椎間盤突出［17］）的發(fā)生發(fā)展和治療中起著重要作用。本文就近年來circRNA在骨科系統(tǒng)疾病中的研究情況作一綜述。

1 CircRNAs的生物學(xué)特性及功能

CircRNAs由3'和5'端相連形成共價(jià)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由于沒有5'-3'的極性以及多聚腺苷酸尾結(jié)構(gòu)，使得其可免受核酸外切酶或水解酶的降解，因而其在細(xì)胞內(nèi)比線性RNA更加穩(wěn)定［1，11］。CircRNAs一般由幾百個(gè)核苷酸構(gòu)成，可來源于基因組的各個(gè)片段，大多數(shù)circRNAs來源于外顯子，主要分布在細(xì)胞質(zhì)，而少數(shù)來源于內(nèi)含子，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。而根據(jù)序列形成和組合方式的不同，可將circRNA分為3種類型：外顯子circRNA（exonic circRNA，ecRNA）、內(nèi)含子 circRNA（ circular intronicRNA，ciRNA）和外顯子-內(nèi)含子circRNA（exon-introncircRNA，EIciRNA）。此外，circRNA還具有高度的物種保守性和時(shí)空特異性，各物種間遺傳穩(wěn)定性較好，在不同物種中存在較多相似序列，但在不同的組織中或同一組織不同的發(fā)育時(shí)期，circRNAs的種類和表達(dá)量亦千差萬(wàn)別［18-19］。

既往大量研究發(fā)現(xiàn)circRNAs可通過不同的分子機(jī)制在眾多疾病的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其主要的分子功能為：①miRNA海綿，circRNAs內(nèi)具有相同的miRNA響應(yīng)元件（miRNA response element，MRE），可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA靶向調(diào)控目的基因的表達(dá)。CDR1as/ciRS-7是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有miRNA分子海綿作用的circRNA，含有74個(gè)miR-7結(jié)合位點(diǎn)，其可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-7而阻礙其目的基因的表達(dá)而發(fā)揮作用［20］。Zhang等［8］證實(shí)BMSCs細(xì)胞中circIGSF11能與miR-199b-5p結(jié)合，從而阻礙miR-199b-5p通過GSK-3β信號(hào)通路來調(diào)節(jié)BMSCs的分化及新骨形成；②直接與mRNA結(jié)合，circRNAs直接參與mRNA選擇性剪接或轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，如ci-ankrd52及ci-sirt7能夠直接與polⅡ復(fù)合物相互作用，下調(diào)相關(guān)錨蛋白重復(fù)域52（parent gene ankrd52）或去乙?；?的基因表達(dá)。EIci-RNA也可與小核糖體U1snRNP相互作用，繼而與polⅡ結(jié)合促進(jìn)親本基因的轉(zhuǎn)錄［21］；③與RNA結(jié)合蛋白相結(jié)合，CDRlas可與miRNA作用因子Ago2蛋白結(jié)合共同發(fā)揮蛋白水解功能［22］。研究發(fā)現(xiàn)circRNAs還可與其他RNA結(jié)合蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定地的RNA-蛋白復(fù)合 體（RNA-protein complexes，RPCs），如 RNA quaking（QKI）、盲肌蛋白（muscle blind，MBL）、真核起始因子4A-III（EIF4A3）等；④直接翻譯合成蛋白，circRNAs可作為翻譯的模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，Wang等［23］在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)載入circRNA-GFP可直接轉(zhuǎn)錄翻譯出完整功能的GFP蛋白。研究發(fā)現(xiàn)在真核細(xì)胞中乙型肝炎病毒的亞病毒衛(wèi)星病毒能夠以天然存在的circRNA形式編碼出單一的蛋白質(zhì)［24］；⑤circRNAs的其他功能：circRNAs能調(diào)控細(xì)胞間信號(hào)通路［25］、影響細(xì)胞分化［8］、形成假基因［26］及參與應(yīng)激反應(yīng)等，從而影響疾病的發(fā)生及發(fā)展過程。

2 CircRNAs與骨科相關(guān)疾病

2.1 CircRNAs與骨性關(guān)節(jié)炎骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種由多種因素引起以關(guān)節(jié)疼痛為主要癥狀的退行性疾病，其病理特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨變性壞死，滑膜炎性病變，骨贅形成。常好發(fā)于中老年人群，65歲以上的人群50%以上為OA患者，也是老年致殘的主要因素之一。既往研究利用基因芯片或高通量測(cè)序技術(shù)在正常軟骨和OA患者關(guān)節(jié)軟骨中篩選出大量差異性表達(dá)的cirRNA并通過生物信息技術(shù)預(yù)測(cè)其靶基因、信號(hào)通路，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，為較多疾病的機(jī)制研究提供重要參考。Zhou等［9］將IL-1β誘導(dǎo)的大鼠OA模型組與正常對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)255種circRNAs出現(xiàn)了差異性表達(dá)，其中在OA模型組中有119種circRNAs表達(dá)上調(diào)，136種circRNAs表達(dá)出現(xiàn)了下調(diào)，并通過熒光定量PCR驗(yàn)證cirRNA-36866，cirRNA-33186，cirRNA-2443，cir-RNA-7063呈顯著性上調(diào)，而cirRNA-30365，cirRNA-33736，cirRNA-2483呈顯著性下調(diào)。也通過GO分析（Gene Ontology）和信號(hào)通路富集分析以及circRNA-miRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建來預(yù)測(cè)差異性表達(dá)circRNAs的功能。Liu等［27］在損傷軟骨與正常軟骨中篩選出104種差異性表達(dá)的circRNAs，其中44種circRNAs表達(dá)上調(diào)，60種circRNAs表達(dá)下調(diào)，并構(gòu)建了包括45種circRNAs、42種miRNAs和42種mRNAs的circRNAs-miRNAs-mRNAs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了circRNAs-MSR可調(diào)控TNF-α的表達(dá)，也可參與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程。

學(xué)者們?cè)诨蛐酒透咄繙y(cè)序研究的基礎(chǔ)上，對(duì)circRNA調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的具體機(jī)制特別是其在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）調(diào)控方面也做了進(jìn)一步的研究。ECM主要由聚集蛋白聚糖（aggregate proteoglycan，AGG）和Ⅱ型膠原（ColⅡ）組成，而基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）則是細(xì)胞外基質(zhì)降解的催化酶。Liu等［28］發(fā)現(xiàn)circRNA-CER能作為miR-136海綿，上調(diào)MMP13表達(dá)，從而促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ECM的降解。Circ-0005105可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-26a也可促使MMP13表達(dá)上調(diào)，同時(shí)抑制ColⅡ和AGG的表達(dá)，共同參與促進(jìn)ECM降解過程［16］。眾所周知，炎性因子白介素（IL）、腫瘤壞死因子、煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、內(nèi)脂素等也在骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展中起著關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)Circ-0005105在促進(jìn)軟骨細(xì)胞ECM降解的同時(shí)也可促進(jìn)PGE2、IL-6、IL-8和煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的生成，提示circ-0005105可能參與促進(jìn)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生。Li等［29］發(fā)現(xiàn)circ-0045714可通過抑制miR-193b的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)miR-193b的靶基因胰島素樣生長(zhǎng)因子2受體表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)軟骨細(xì)胞ColⅡ和AGG表達(dá)，提示circ-0045714可抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，為OA的治療提供了新的思路。

2.2 CircRNAs與骨肉瘤骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是原發(fā)于骨髓腔的高度惡性實(shí)體腫瘤，起源于間葉組織，好發(fā)于10～20歲青少年，惡性程度高，易于復(fù)發(fā)和肺部轉(zhuǎn)移，預(yù)后也較差。近年來研究發(fā)現(xiàn)circRNAs在骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展、遷移、惡變中發(fā)揮著重要作用。Chen等［14］將骨肉瘤細(xì)胞系（MG63，Saos-2及U2OS）與正常成骨細(xì)胞（hFOB）對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)110種circRNAs呈差異性表達(dá)，骨髓瘤細(xì)胞存在8種circRNAs表達(dá)上調(diào)，102種circRNAs表達(dá)下調(diào)，通過生物信息分析預(yù)測(cè)circRNA-101391、circRNA-101139、circRNA-100413可能作為 miR-338-3p及miR-142-5p的分子海綿，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞黏附因子1（cell adhesion molecules 1，CADM1）基因的表達(dá)。而CADM1作為一種新的抑癌基因，廣泛參與細(xì)胞間黏附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，常在惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)，因而提示上述circRNAs可能為治療骨肉瘤的新的方向。Zhang等［30］分別將骨肉瘤細(xì)胞與正常成骨細(xì)胞、30例骨肉瘤患者腫瘤標(biāo)本與瘤旁正常組織對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)circRNA-UBAP2在骨肉瘤細(xì)胞及骨肉瘤患者腫瘤標(biāo)本中均存在明顯過量表達(dá)，其表達(dá)量與腫瘤分級(jí)和患者生存時(shí)間也顯著相關(guān)，進(jìn)一步研究可知其能作為miR-143的分子海綿，促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因B淋巴細(xì)胞瘤-2的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，因而提示circRNA-UBAP2可能作為一種致癌基因在OS形成生長(zhǎng)中起到促進(jìn)作用。Deng等［31］研究認(rèn)為circ-009910能作為miR-449a的分子海綿刺激激活I(lǐng)L-6R的表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)JAK1/STAT3信號(hào)通路來調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡和壞死，因而提示circRNAs可能作為治療骨肉瘤的潛在靶點(diǎn)。

而在治療上雖然新輔助化療使得骨肉瘤的5年生存率提高到50%以上，但隨著生存期的延長(zhǎng)，部分骨肉瘤患者對(duì)常規(guī)化療藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥，會(huì)造成腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及生存時(shí)間。Zhu等［25］通過比較80例術(shù)前采用2周期新輔助化療（MTX，DXR，DDP，IFO）的骨肉瘤患者腫瘤標(biāo)本及瘤旁正常組織發(fā)現(xiàn)circRNA-PVT1在OS組織中明顯過量表達(dá)，并在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中將3組耐藥骨肉瘤細(xì)胞株及非耐藥骨肉瘤細(xì)胞株（MG63R vs MG63，U2OSR vs U2OS，KHOSR vs KHOS）及正常成骨細(xì)胞（hFOB）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)六種骨肉瘤細(xì)胞株中circRNA-PVT1含量均明顯高于正常細(xì)胞組，而3種耐藥骨肉瘤細(xì)胞株的circRNA-PVT1含量亦明顯高于非耐藥骨肉瘤細(xì)胞株。將特異性靶向circRNAPVT1基因的siRNA轉(zhuǎn)染入耐藥性細(xì)胞株中（MG63R，U2OSR），耐藥組骨肉瘤細(xì)胞株對(duì)化療藥物（DDP、DXR）的IC50值及耐藥組細(xì)胞活力均明顯降低，提示circRNA-PVT1能明顯減弱骨肉瘤細(xì)胞的耐藥性能。ATP結(jié)合蛋白亞家族1抗體（ATP-binding cassette sub-family B member 1，ABCB1）是 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)其在人類多種腫瘤細(xì)胞（如卵巢癌、乳腺癌等）細(xì)胞中均過度表達(dá)并參與多種組織來源的腫瘤多藥耐藥的形成［32］。研究發(fā)現(xiàn)circRNA-PVT1能通過下調(diào)ABCB1基因的表達(dá)來削弱多耐藥骨肉瘤細(xì)胞的耐藥性能，可為耐藥性骨肉瘤的治療提供新的潛在靶點(diǎn)［25］。

2.3 CircRNAs與腰椎椎間盤退變腰椎間盤退行性疾病是骨科門急診常見的以下腰痛為主要表現(xiàn)的疾病，其終生患病率可高達(dá)39%以上。研究發(fā)現(xiàn)circRNAs也參與椎間盤退變過程，在其疾病的發(fā)生發(fā)展以及治療中也起著至關(guān)重要的作用。Zhou等［33］將退變的椎間盤與脊柱側(cè)彎患者正常的椎間盤進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)636種circRNAs出現(xiàn)了差異性表達(dá)，其中在退變的椎間盤組中有354種circRNAs表達(dá)上調(diào)，282種circRNAs表達(dá)出現(xiàn)了下調(diào)，通過RT-qPCR驗(yàn)證circRNA-103890的差異性表達(dá)，并利用生信分析預(yù)測(cè)circRNA-103890可能通過特異性位點(diǎn)與miR-185-5p結(jié)合進(jìn)而調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。Song等［34］將脊髓型頸椎病的椎間盤組織與平山?。╤irayama disease）患者的椎間盤通過基因芯片技術(shù)篩選出792種circRNAs出現(xiàn)了差異性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組有428種circRNAs表達(dá)上調(diào)，364種circRNAs表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)has-circRNA-104670的表達(dá)量與椎間盤Pfirmann分級(jí)有明顯的線性相關(guān)性，也即退變分級(jí)越高，circRNA-104670的表達(dá)量越多。研究發(fā)現(xiàn)circRNA-104670能作為miR-17-3p分子海綿，競(jìng)爭(zhēng)性抑制miR-17-3p靶基因的表達(dá)，進(jìn)而使MMP-2的表達(dá)上調(diào)、COL-II的表達(dá)下調(diào)，因此提示circRNA-104670能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-17-3p而促進(jìn)ECM的降解進(jìn)而參與椎間盤退變的發(fā)生及發(fā)展。Cheng等［17］發(fā)現(xiàn)circ-VMA21能抑制凋亡相關(guān)蛋白酶（caspase-3，caspase-7，caspase-9）以及細(xì)胞外基質(zhì)降解酶（MMP-3，MMP-3，ADAMTS-4，ADAMTS-5）在髓核細(xì)胞的表達(dá)，同時(shí)也能促進(jìn)COL-II及AGG的表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circ-VMA21作為分子海綿競(jìng)爭(zhēng)性地與miR-200c結(jié)合，從而調(diào)節(jié)XIAP信號(hào)通路來參與椎間盤的退變過程。研究還通過向小鼠退變模型注射circ-VMA21驗(yàn)證其可減緩小鼠椎間盤退變模型椎間盤的退變，為椎間盤退變的相關(guān)疾病的治療提供了新的方向。

2.4 CircRNAs與骨質(zhì)疏松癥骨質(zhì)疏松癥是一種老年人尤其是絕經(jīng)后婦女常見的全身性骨代謝障礙性疾病，其特征是骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，從而致使骨脆性增加而極易發(fā)生骨折［35-36］。目前公認(rèn)的骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)是雙能X線吸收檢測(cè)法測(cè)量的結(jié)果，其診斷標(biāo)準(zhǔn)為T值≤-2.5。Jin等［37］將骨質(zhì)疏松癥患者與正常人血清樣本進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者中有106種circRNAs表達(dá)上調(diào)，154種circRNAs表達(dá)下調(diào)，其中差異性最為顯著的 10種 circRNA分別為 circRNA-0010452、circRNA-0022348、 circRNA-0015566、 circRNA-0003323、circRNA-0013121和circRNA-0021739、circRNA-0011269、 circRNA-0019693、 circRNA-0005245、circRNA-0010349。Zhao等［38］將41例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者與58例絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松癥患者的血液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)381種circRNAs出現(xiàn)差異表達(dá)的（203種上調(diào)和178種下調(diào)），并通過RT-qPCR證實(shí)circ-0001275在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥組內(nèi)呈高表達(dá)，線性回歸分析提示circ-0001275與骨密度值呈顯著相關(guān)性，其ROC曲線下面積為0.759，特異度和敏感度分別為0.853和0.664，因而circ-0001275可作為一種新型的診斷標(biāo)記物應(yīng)用于診斷絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥。

眾所周知，骨代謝是成骨細(xì)胞骨形成與破骨細(xì)胞骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡過程，成骨細(xì)胞減少或破骨細(xì)胞的增多致使該平衡被打破，易引起骨質(zhì)疏松癥。Dou等［39］研究發(fā)現(xiàn)circRNAs參與破骨細(xì)胞形成的過程，在前體期、成熟期和活化期均有不同種類的circRNA呈差異性的上調(diào)和下調(diào)，采用VENN分析發(fā)現(xiàn)在破骨細(xì)胞的3種狀態(tài)下有24種相同的circRNAs均出現(xiàn)顯著的差異性表達(dá)，并根據(jù)生信分析推測(cè)circRNA-010763可能與miR-103表達(dá)有關(guān)。隨后研究也證實(shí)了circRNA-010763在絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松組患者中存在明顯差異性表達(dá)現(xiàn)象［37］。由此可見circRNAs在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，同時(shí)外周全血中circRNA含量也高于相應(yīng)線性RNA水平，同時(shí)自身環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其擁有良好的穩(wěn)定性，故有望成為骨質(zhì)疏松癥診斷的分子生物標(biāo)記物。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

CircRNAs本身特有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)賦予了其獨(dú)特的功能，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)circRNAs在很多疾病的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、惡變和轉(zhuǎn)移等過程中都發(fā)揮著重要作用。但當(dāng)前cirRNA在骨科疾病中的研究主要還是集中在其作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA（ceRNA）發(fā)揮分子海綿作用吸附miRNA進(jìn)而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯過程方面。而cirRNA參與調(diào)控mRNA選擇性剪接或轉(zhuǎn)錄、與RNA結(jié)合蛋白相結(jié)合發(fā)揮蛋白降解功能以及直接翻譯合成蛋白等其他的分子功能是否也參與骨科疾病的調(diào)控尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。circRNAs自身環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其具有比miRNA和lncRNA較好的穩(wěn)定性，隨著對(duì)circRNAs的研究深入，筆者認(rèn)為circRNAs終將在骨科疾病的發(fā)病機(jī)制、特異性診斷、靶向基因治療等方面發(fā)揮其巨大的潛能。