張凱煜，谷 潔，王小娟，高 華

( 西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100 )

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，對土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分循環(huán)，維持土壤肥力和可持續(xù)利用至關(guān)重要，在農(nóng)業(yè)土壤生態(tài)系統(tǒng)中的作用越來越受到關(guān)注[1-2]。核桃在黃龍縣栽培歷史悠久[3]。近年來，農(nóng)民粗放式的施肥管理模式存在盲目性，長期大量施用化肥也會影響土壤微生物活性，進(jìn)而降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，并造成一定的環(huán)境問題[4-5]。

生物有機肥是將外源功能菌接種到堆肥產(chǎn)品，即以畜禽糞便、農(nóng)作物秸稈等為原料，經(jīng)腐熟的有機肥產(chǎn)品。具有生物肥料和有機肥效應(yīng)，有利于增產(chǎn)增收，還能培肥土壤，減少化肥的用量，同時實現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用[6-7]。張婷婷[8]研究了不同施肥對核桃生長和品質(zhì)的影響，提出施用生物菌肥和骨粉可有效提高核桃園土壤中有機質(zhì)含量。楊建榮等[9]發(fā)現(xiàn)，生物有機肥的應(yīng)用能顯著提高核桃產(chǎn)量，改善土壤保水性和供肥能力。研究表明，施用生物有機肥能調(diào)節(jié)土壤中微生物組成[10]，提高作物抗病性[11-12]，使土壤健康發(fā)展。杜瀅鑫等[13]利用PCR-DGGE和Biolog發(fā)現(xiàn)不同植物根際土壤微生物組成不同。Araújo等[14]通過T-RFLP方法發(fā)現(xiàn)，土地退化降低了土壤細(xì)菌的多樣性，影響了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。由于高通量測序技術(shù)具有測序深度深和獲得數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點，可揭示復(fù)雜微生物群落的多樣性，加快了環(huán)境中不可培養(yǎng)和痕量微生物的研究[15]，已成為研究微生物群落變化的主要方法之一。朱金山等[16]利用高通量測序技術(shù)對不同沼灌年限稻田土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，從門、綱、目、科、屬5個水平上全面展示了稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分布。在化肥和生物有機肥處理下，土壤細(xì)菌群落的響應(yīng)差異，不同處理土壤微生物區(qū)系的差異如何？哪些關(guān)鍵因素能夠影響微生物進(jìn)而調(diào)控土壤養(yǎng)分循環(huán)，還需要進(jìn)一步研究。

本研究在試驗區(qū)設(shè)置了不同施肥處理試驗，采用高通量測序法比較不同施肥種類對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，并結(jié)合土壤性狀揭示細(xì)菌群落變化的驅(qū)動因子，旨在從土壤微生物生態(tài)的角度豐富生物有機肥的促生理論，闡明施肥管理措施影響土壤肥力的生物學(xué)機制，為指導(dǎo)核桃合理施肥提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2016年9月在陜西省延安市黃龍縣三岔鄉(xiāng)進(jìn)行(109°83′ N，35°58E)，供試品種為香鈴。供試的生物有機肥由西北農(nóng)林科技大學(xué)自制(添加的主要功能菌為解磷菌和解鉀菌，有效活菌數(shù)達(dá)2.8×108cfu·g-1)，有機質(zhì)含量28.3%、氮(N) 3.8%、磷(P2O5) 2.6%、鉀(K2O) 3.1%。試驗設(shè)置3個處理，CK(不施肥)，TN(常規(guī)施肥，施肥量為復(fù)合肥1 350 kg·hm-2，含N 15%、P2O515%、K2O 15%)，TB(施生物有機肥，施肥量為5 325 kg·hm-2，以化肥養(yǎng)分氮含量折算即N 202.5 kg·hm-2、P2O5138 kg·hm-2、K2O 165 kg·hm-2)。一年兩次施肥，即基肥、追肥，施肥量各占50%。

1.2 土壤樣品采集

于2017年9月沿種植行，樹干周圍50 cm的根系密集分布區(qū)，使用“S形”五點法采集土壤樣品。采樣時去掉易受水分及各種環(huán)境因素影響的表層干土后，取5～20 cm土壤樣品，用無菌鑷子去除殘留根系后裝入無菌自封袋，用冰盒迅速帶回實驗室。取1份樣品經(jīng)冷凍干燥后，用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析，另1份風(fēng)干過篩，用來測定理化指標(biāo)。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤DNA提取 土壤樣品DNA使用FastDNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals，美國)進(jìn)行提取。利用Nanodrop Spectrophotometer ND-1000 (Thermo Fisher Scientific，美國) 檢測DNA濃度和純度，確保樣品濃度和純度合格后，保存于-80℃冰箱。

1.3.2 高通量測序 將土壤DNA樣品寄送至北京諾禾致源科技股份有限公司，進(jìn)行16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)高通量測序。通過UPARSE將序列在97%相似水平下進(jìn)行聚類，獲得可操作分類單元(OTUs)。利用QIIME進(jìn)行抽平、RDP分類，得到樣品OTUs詳細(xì)的注釋結(jié)果，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.3 土壤理化性質(zhì)的測定 測定方法參考土壤農(nóng)化分析[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用SPSSv 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析和方差分析(LSD，P<0.05)，用Microsoft Excel 2013進(jìn)行繪圖。利用CANOCO 4.5軟件進(jìn)行冗余分析，R軟件繪制熱度圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)

從表1可以看出，與CK處理相比，TB處理中有機質(zhì)、全氮、全磷分別增加了46.3%、30.6%和50.8%。生物有機肥的施用顯著提高了核桃園土壤中全磷、全氮和有機質(zhì)含量(P<0.05)。全鉀含量在不同處理間無顯著差異，在14.3～14.6 g·kg-1波動。各處理速效養(yǎng)分含量大小順序為：TB>TN>CK，其中TB處理速效磷和速效鉀含量分別達(dá)CK處理1.76倍和1.78倍。

2.2 土壤細(xì)菌群落多樣性

高通量測序結(jié)果顯示每個樣品OTUs稀釋性曲線均趨于平坦(圖1)，說明測序數(shù)據(jù)量和測序深度合理，可包括土壤樣品中的大部分的細(xì)菌類型。分析了代表微生物群落α-多樣性的辛普森指數(shù)、Chao1、香濃指數(shù)和ACE指數(shù)，其值越高表示微生物多樣性、物種豐富度越高[18]。由圖2可見，TB處理α-多樣性指數(shù)均高于CK和TN處理，而TN處理香濃指數(shù)和ACE指數(shù)有所降低。

2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

基于門水平，分析了不同土壤樣本序列(圖3),共得到35個門水平類群。結(jié)果顯示優(yōu)勢類群包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，共占細(xì)菌總量的85.2%～90.6%。進(jìn)一步比對分析，共得到291個屬水平類群，其中鞘脂單細(xì)胞菌屬(Sphingomonas,phylum-Proteobacteria, 6.6%～10.0%)節(jié)桿菌屬(Arthrobacter,phylum-Actinobacteria, 2.3%～4.7%)為優(yōu)勢類群(圖4)，TB處理較CK處理分別增加了17.6%和56.6%，較TN處理分別增加了51.5%和104.3%。

圖1 土壤樣本稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of soil samples

表1 不同施肥處理下的土壤化學(xué)性質(zhì)

圖2 不同施肥處理下的土壤細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)Fig.2 Abundances of bacterial community α-diversity indexes under different fertilizer treatment

以門水平上細(xì)菌相對豐度和與土壤pH、有機質(zhì)、堿解氮、全氮、速效磷、全磷、速效鉀、全鉀進(jìn)行冗余分析(圖5)，可分析細(xì)菌群落和多個響應(yīng)變量(土壤理化性質(zhì))之間的關(guān)系[19]。結(jié)果顯示，所選取的環(huán)境因子共解釋細(xì)菌群落變化的94.6%，RD1軸解釋了82.5%，RD2軸解釋了12.1%。其中土壤有機質(zhì)、堿解氮和速效鉀含量為不同施肥處理間細(xì)菌群落差異的主要驅(qū)動因子。

圖3 基于門水平的不同施肥處理下土壤細(xì)菌群落組成Fig.3 Soil bacterial community composition in different fertilization treatments at phylum level

圖4 不同施肥處理下的土壤細(xì)菌群落優(yōu)勢菌屬Fig.4 Predominant genera of soil bacterial community in different fertilization treatments

注：TP：全磷；AN：堿解氮；OM：有機質(zhì)；AK：速效鉀；AP：速效磷；TK：全鉀；TN：全氮。Note: TP: Total phosphorus; AN: Alkali-hydrolyzable N; OM: Organic matter; AK: Available K; AP: Available P; TK: Total potassiam; TN: Total nitrogen.圖5 不同施肥處理下的環(huán)境因子對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的RDA排序圖Fig.5 Redundancy analysis between soil properties and the bacterial community structure

3 討 論

生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性及土壤肥力發(fā)生變化的關(guān)鍵因素是人為向土壤中大量輸入外源物質(zhì)，尤其是肥料[20-21]，不同的施肥方式和肥料類型影響又有所不同。生物有機肥的施用能夠提高土壤有機質(zhì)和全氮含量，這與前人研究結(jié)果相似[22]。常規(guī)施肥對土壤速效養(yǎng)分的提高效果不如生物有機肥，尤其是土壤中速效鉀和速效磷含量。這可能主要是因為生物有機肥中含有解磷菌、解鉀菌可作用于土壤中難溶的磷和鉀，釋放出大量速效磷、速效鉀。生物有機肥既能在作物生長前期快速提供一定的速效養(yǎng)分，又可在作物生長過程中通過微生物分解有機質(zhì)和礦物質(zhì)釋放養(yǎng)分，發(fā)揮速效和長效兼有的作用，養(yǎng)分的緩慢釋放還可為微生物提供更穩(wěn)定的棲息環(huán)境，起到“接種”和“導(dǎo)入”作用[23- 24]。

土壤細(xì)菌在土壤養(yǎng)分循環(huán)和系統(tǒng)維穩(wěn)中起重要作用[25]。本研究結(jié)果表明，施用生物有機肥顯著增加了土壤細(xì)菌群落多樣性，可能是因為施肥處理中較高的有機質(zhì)和養(yǎng)分，為更多的微生物提供了生長和繁殖的條件，其中包括生物有機肥中本來攜帶的大量功能菌[26]。與不施肥相比，常規(guī)施肥卻降低了細(xì)菌群落香濃指數(shù)和ACE指數(shù)，這與蘇婷婷等[11]的研究結(jié)果相似。Liu等[27]通過Biolog方法發(fā)現(xiàn)施用有機肥處理香濃指數(shù)顯著高于化肥處理，Chen等[28]發(fā)現(xiàn)接種微生物菌劑能夠顯著提高土壤豐富度指數(shù)。綜上表明，生物有機肥優(yōu)于常規(guī)肥料的關(guān)鍵因素就在于這些功能菌的生命活動。

通過對不同施肥處理對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析，得到35個門水平和291個屬水平的類群。結(jié)果表明，不同處理中優(yōu)勢的門、綱和目水平上優(yōu)勢物種相似，但不同處理處理間，門、綱和目水平物種相對豐度不盡相同。變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門為優(yōu)勢門類，這與某些前期研究結(jié)果相似[16, 29]。而不同研究中物種豐度差異較大，說明農(nóng)田土壤中細(xì)菌群落優(yōu)勢物種種類相似，但其相對豐度會受土壤類型、種植作物類型以及施肥灌溉方式等的影響[30-31]。放線菌門在土壤氮素循環(huán)中起重要作用，還能促進(jìn)土壤中植物殘體的腐爛。本研究中，各處理放線菌門豐度大小為TB>TN>CK，與全氮和堿解氮趨勢一致，這與王伏偉等[32]研究相似。他研究了施肥和秸稈還田對砂漿黑土細(xì)菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)施肥和秸稈還田顯著提高了放線菌門的相對豐度,并且土壤全氮含量是提高其相對豐度的重要原因。而楊亞東等[29]研究結(jié)果表明在OTUs水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與全氮含量顯著相關(guān),但門水平上則相關(guān)性不顯著。這表明全氮含量對細(xì)菌不同分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)影響存在差異。在屬水平上，不同處理中，鞘脂單細(xì)胞菌屬和節(jié)桿菌屬菌為優(yōu)勢物種，但在不同處理中相對豐度不同(TB>CK>TN)。鞘脂單細(xì)胞菌屬可以促進(jìn)根際營養(yǎng)吸收，抵抗多種病原菌，是降解土壤有毒物質(zhì)最有效的微生物菌屬之一。也有研究發(fā)現(xiàn)，鞘脂單細(xì)胞菌屬中部分菌株具有固氮特性，在土壤氮素轉(zhuǎn)化方面起重要作用[33]。節(jié)桿菌屬可以通過固氮作用產(chǎn)生多種植物激素，以促進(jìn)水分和礦質(zhì)元素的吸收。由此可見，施用生物有機肥可以促進(jìn)優(yōu)勢菌的富集，促進(jìn)營養(yǎng)和水分等吸收，其是否能提高根際微生物抗病抗毒害能力，還需要今后長期試驗來證實。

土壤微生物群落組成會受到環(huán)境變化的影響，可以作為土壤質(zhì)量變化的指標(biāo)。武發(fā)思[34]研究發(fā)現(xiàn)有機肥對根際土壤細(xì)菌多樣性的增加和群落結(jié)構(gòu)的改變作用明顯。本文采用冗余分析(RDA)來研究環(huán)境因子對微生物群落的影響，將RDA分析加入高通量生物信息分析，能夠更直觀地表達(dá)影響研究區(qū)土壤細(xì)菌群落特征的主要土壤環(huán)境因素，是分析土壤微生物信息的有效方法，能夠為土壤環(huán)境評價以及土地利用管理提供科學(xué)依據(jù)。RDA結(jié)果表明，施肥處理即TB和TN處理在RD1軸上與CK處理顯著區(qū)分，有機質(zhì)、堿解氮和速效鉀是土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變的主要驅(qū)動因子。有機質(zhì)改變了土壤孔隙度、通氣度與土壤團粒結(jié)構(gòu)[35]，具有一定的緩沖作用，作為土壤酶的重要載體，為土壤微生態(tài)環(huán)境提供化學(xué)反應(yīng)場所，為細(xì)菌活動提供適宜條件。而堿解氮和速效鉀對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，可能和核桃本身養(yǎng)分需求相關(guān)。

4 結(jié) 論

施生物有機肥可顯著提高核桃園土壤養(yǎng)分，使土壤理化性質(zhì)得到改善，且生物有機肥效果優(yōu)于常規(guī)施肥。施生物有機肥增加了土壤細(xì)菌群落多樣性，在一定程度上還提高了土壤中優(yōu)勢菌屬的相對豐度。不同施肥處理改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成，冗余分析結(jié)果表明，土壤有機質(zhì)、堿解氮和速效鉀含量是影響細(xì)菌群落變化的主要驅(qū)動因子。本研究采用了高通量測序的方法，結(jié)合環(huán)境因子對土壤細(xì)菌群落對不同施肥處理的響應(yīng)進(jìn)行了分析，后續(xù)可以利用宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組的方法，對參與碳、氮、磷循環(huán)功能微生物的表達(dá)、代謝途徑進(jìn)行深入研究。