孫玉剛 劉助先 韓志強(qiáng) 肖水清 張玉杰

固定矯治過程中由于矯治器的戴入，不利于清潔，形成局部刺激而導(dǎo)致牙齦炎性反應(yīng)的產(chǎn)生。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是目前公認(rèn)的慢性牙齦炎的主要致病菌之一，能分泌大量的毒力因子，破壞牙周組織，在牙周病的發(fā)病過程中起重要作用[1]。致病島（pathogenicity islands）的發(fā)現(xiàn)使人們對細(xì)菌致病性有了進(jìn)一步的認(rèn)識。目前，rag位點(diǎn)被確定為牙齦卟啉單胞菌的致病島基因之一，研究證實(shí)，rag位點(diǎn)的失活會使牙齦卟啉單胞菌的致病性降低，對牙周組織的破壞減少[2，3]。rag位點(diǎn)在臨床菌株中有4種不同的基因型，分別命名為rag-1、rag-2、rag-3和rag-4，不同基因型的致病能力亦不同[3，4]。我們分別取矯治前，矯治器戴入后1、2、3、6、12個月的齦溝液標(biāo)本，采用16S rDNA PCR技術(shù)及多重PCR技術(shù)檢測其中的牙齦卟啉單胞菌及致病島rag基因，分析牙齦卟啉單胞菌及致病島rag基因在正畸治療早期的變化，探討其與牙齦炎性反應(yīng)的關(guān)系。

資料和方法

1.臨床資料：從正畸科隨機(jī)選取矯治器戴入前牙齦正常的青少年患者45例，其中女30例，男15例。分別取正畸治療前，正畸治療中第1、2、3、6、12個月的齦溝液標(biāo)本。選擇標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均采用直絲弓固定矯治。3個月內(nèi)未服用任何抗生素或引起牙齦增生的藥物。正畸醫(yī)師應(yīng)在正畸矯治開始前1周使用專業(yè)口腔檢查器械仔細(xì)檢查患者口腔衛(wèi)生狀況和存在的牙體牙周疾病，如有口腔疾病應(yīng)告知患者及早治療。矯治器戴入后，要求患者早晚及三餐后均認(rèn)真仔細(xì)地且采用改良Bass法刷牙，充分做好口腔衛(wèi)生的防護(hù)。實(shí)驗(yàn)過程中不能按時復(fù)診的中途剔除。

2.標(biāo)本采集[5]：無菌紙尖法收集標(biāo)本，由同一位醫(yī)師對實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行臨床檢查和記錄，并收集標(biāo)本。

3.DNA提?。翰捎眉訜崃呀夥ㄌ崛NA，并于-20℃保存[5]。

4.引物設(shè)計(jì)及合成[6]

表1 牙齦卟啉單胞菌及4種rag基因型的引物序列及大小

5.PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系：各標(biāo)本反應(yīng)體系均為25ul，DNA模板均為5ul，采用TransStart Taq DNA Polymerase PCR試劑盒。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min（33個循環(huán)）；最后72℃延伸10min；4℃保存。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、16S rDNA PCR及多重PCR對臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果

16S rDNA PCR：標(biāo)準(zhǔn)菌株1和臨床標(biāo)本3，4，5，7，8均擴(kuò)增出目的條帶（404bp），而臨床標(biāo)本2，6，9未擴(kuò)增出目的條帶，見圖1。

多重PCR檢測結(jié)果：臨床標(biāo)本a、b、d均擴(kuò)增出rag-1型（628bp），c擴(kuò)增出rag-2型（979bp），e擴(kuò)增出rag-3型（423bp），d擴(kuò)增出rag-4型（739bp）見圖2。

圖1 16S rDNA PCR對臨床標(biāo)本中Pg的檢測結(jié)果

圖2 多重PCR對致病島rag基因的檢測結(jié)果

表2 普通PCR及多重PCR對臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，從正畸治療前、正畸治療后第1、2、3、6、12個月牙齦卟啉單胞菌的檢出率可看出，Pg在正畸治療后前2個月逐漸上升，2個月后開始下降，到第6個月和12個月基本趨于穩(wěn)定，但仍高于矯治器戴入前（表2、圖3）。由rag基因的檢出率可看出，rag基因的檢出率在正畸治療第一個月開始上升，到第2、3個月時最高，3個月后逐漸下降，到第6個月和12個月時趨于穩(wěn)定，但仍高于矯正前（表2、圖3）。

二、P.gingivalis及致病島rag基因檢出率與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系（表3）

牙齦卟啉單胞菌和致病島rag基因的檢出率與GI和時間t之間均存在明顯的正相關(guān)關(guān)系（Spearman等級相關(guān)分析，rs＝1.000，P＜0.01）。

圖3 Pg與rag基因檢出率

三、4種Rag基因型牙齦卟啉單胞菌臨床菌株的分布情況

4種不同rag基因型牙齦卟啉單胞菌菌株的分布情況見表4。從總檢出例數(shù)來看，rag-3型的檢出率最高，rag-4型次之，rag-1和rag-2型相對較低，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 牙齦卟啉單胞菌及rag基因檢出率與GI之間的關(guān)系

表4 4種Rag基因型Pg臨床菌株的分布情況

討 論

隨著社會的進(jìn)步，生活水平的提高，人們對口腔保健越來越重視。近幾年來，接受正畸治療的人越來越多。但固定矯治器由于不利于清除食物殘留，易導(dǎo)致牙齦炎癥的產(chǎn)生[7]。有研究發(fā)現(xiàn)正畸患者在矯治過程中如若能保持良好的口腔衛(wèi)生，那么就可以降低牙齦炎的發(fā)生率[8]。目前，越來越多的正畸醫(yī)師開始關(guān)注正畸治療中口腔的衛(wèi)生和牙周組織的健康問題。近年研究結(jié)果表明，齦下菌斑是引起牙齦炎癥的始動因子，大多牙齦病都是由微生物感染所致[6]。牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）是目前公認(rèn)的重要牙周致病菌[1]。

本實(shí)驗(yàn)對臨床標(biāo)本中的牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行檢測，Pg檢出率在正畸治療前2個月逐漸升高，2個月后又逐漸下降，到第6個月和12個月基本趨于穩(wěn)定，但仍高于矯治前，說明矯治器的戴入對正畸初期口腔微生物動態(tài)平衡的影響較大。曾有人對不同時期固定正畸治療患者口腔細(xì)菌進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，并與GI進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明：矯治器對口腔微生態(tài)平衡影響的關(guān)鍵時期是戴用后前3個月[9]。

病原菌致病是多種因素、多種原因共同作用的結(jié)果，致病島的發(fā)現(xiàn)使人們對細(xì)菌致病機(jī)制及致病性有了更深入的認(rèn)識。致病島又稱毒力島，是一個分子質(zhì)量相對較大的基因片段，用于編碼細(xì)菌毒力基因簇，是整合于細(xì)菌基因DNA組的外源性成分，其可能來自于細(xì)菌進(jìn)化過程中DNA的基因水平轉(zhuǎn)移事件。目前，rag位點(diǎn)被確定是牙齦卟啉單胞菌的致病島基因之一[3，4]。該位點(diǎn)主要含有ragA和ragB基因，分別編碼RagA和RagB蛋白。Rag蛋白構(gòu)成膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，協(xié)助細(xì)菌從外部環(huán)境獲取轉(zhuǎn)運(yùn)大分子，利于細(xì)菌的存活和播散；同時Rag蛋白還能夠激活宿主的免疫及炎癥反應(yīng)[10]研究證實(shí)，rag位點(diǎn)的失活會使牙齦卟啉單胞菌致病性降低，對牙周組織的破壞減少[11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，rag基因的檢出率在正畸治療第一個月開始上升，到第2、3個月時最高，3個月后逐漸下降，到第6個月和12個月時趨于穩(wěn)定，但仍高于矯正前。GI在正畸治療后逐漸升高，第2個月達(dá)到高峰，然后逐漸下降，與rag基因的檢出率呈正比。研究結(jié)果表明致病島rag基因在正畸早期牙齦炎的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用。

rag位點(diǎn)在臨床菌株中有4種不同的基因型，分別命名為rag-1、rag-2、rag-3和rag-4[11，12]。Amano等[13]研究報(bào)道，兩種或幾種不同基因型的牙齦卟啉單胞菌菌株可以存在于同一個患者齦下菌斑中。本研究中也發(fā)現(xiàn)同一個樣本中可同時檢測出幾種基因型的牙齦卟啉單胞菌。本研究結(jié)果中：rag-3型牙齦卟啉單胞菌檢出率最高，rag-4型次之，rag-1型和rag-2型的檢出率相對較低。Hall等[12]研究發(fā)現(xiàn)不同國家和地區(qū)的牙齦卟啉單胞菌的rag基因型的分布不同，有一定的地域或種族的差異。本研究結(jié)果認(rèn)為rag-3型牙齦卟啉單胞菌與該地區(qū)青少年正畸牙齦炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系更為密切。