張素欣 李天客 郭 杰 包 陽(yáng) 宋 艷 常晴晴 陳 中

OSCC的治療手段目前仍是以手術(shù)治療為主，化、放療、生物治療相結(jié)合的綜合治療，雖然近些年來(lái)治療手段越來(lái)越豐富，設(shè)備也越來(lái)越先進(jìn)，國(guó)際上光動(dòng)刀療法及靶向治療有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是由于OSCC浸潤(rùn)性強(qiáng)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早、復(fù)發(fā)率高，因此患者術(shù)后生存質(zhì)量較差、預(yù)后不理想。所以提前發(fā)現(xiàn)病灶，并把癌變過(guò)程控制在早期階段顯得尤為重要。

人類的前列腺蛋白（Prostasin）基因又被簡(jiǎn)稱為PRSS8或CAP-1，是一種于1994年首次在人體精液中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶（40KDa）。PRSS8在上皮屏障功能上顯示了其重要性，而且參與多種炎癥、表皮生長(zhǎng)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[1]。研究表明PRSS8在胃癌[2]，乳腺癌[3]，食管癌[4]，膀胱癌[5]，前列腺癌[6，7]組織細(xì)胞中起到抑癌基因的作用，并且在上述癌癥中均因高度甲基化導(dǎo)致了PRSS8表達(dá)的減少。PRSS8可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種通路抑制多種腫瘤的發(fā)生，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。但目前尚未發(fā)現(xiàn)PRSS8在OSCC中的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)利用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylation specific PCR，MSP）及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase-PCR，RT-PCR）法分析52例OSCC組織及相應(yīng)癌旁2cm處的正?？谇火つそM織中PRSS8基因的表達(dá)情況及甲基化狀態(tài)，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析，進(jìn)一步揭示OSCC的發(fā)病機(jī)制，為OSCC的早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)后的判斷提供理論依據(jù)。

資料和方法

1.實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象：本實(shí)驗(yàn)研究所采用標(biāo)本均來(lái)自于2014年8月至2016年8月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科住院并行手術(shù)治療的OSCC患者。所取標(biāo)本包括每例患者的OSCC原發(fā)灶組織和在距離原發(fā)灶2cm處切取的正?？谇火つそM織，52例OSCC中男性患者30例，女性患者22例，男女比例為1.36：1。年齡最大者79歲，年齡最小者25歲，平均年齡58.3歲，吸煙史（≥3支/天，時(shí)間≥1年），吸煙29例，不吸煙23例。飲酒史（≥50ml/天，時(shí)間≥1年），飲酒27例，不飲酒25例。按照2010年AJCC對(duì)唇和口腔鱗癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)術(shù)后病人進(jìn)行TNM分期，其中Ⅰ+Ⅱ期21例，Ⅲ+Ⅳ期31例。依據(jù)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例。按照1997年WHO推薦將FuhrmanⅠ、Ⅱ級(jí)合并為高分化，F(xiàn)uhrmanⅢ級(jí)為中分化，F(xiàn)uhrmanⅣ級(jí)為低分化，高中分化組為34例，低分化組18例。所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)，標(biāo)本離體后均迅速保存于液氮中，之后轉(zhuǎn)移至生物標(biāo)本庫(kù)-80℃冰箱統(tǒng)一保存管理。本研究已通過(guò)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.主要試劑和儀器（表1）。

PRSS8基因RT-PCR引物序列：上游：5'-ACTGCTCGCTTCGGATACTC-3'；下游：5'-CAGGCACGCAAGGTAGGAA-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為174bp，退火溫度56℃。

PRSS8基因甲基化引物序列：上游：5'-TTATAGGTATTCGTTATTACGTTCG-3'；下游：5'-ACACTTTAAAAAACCGAAACCGACG-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為126bp，退火溫度55℃。

表1 主要試劑和儀器

3.MSP檢測(cè)OSCC組織和癌旁組織中PRSS8甲基化狀態(tài)：應(yīng)用DNA提取試劑盒提取OSCC組織中的DNA并進(jìn)行純化。設(shè)計(jì)相應(yīng)的MSP引物及非甲基化特異性引物。擴(kuò)增條件∶95℃，預(yù)變性10分鐘，一個(gè)循環(huán)；94℃，變性，45秒，退火溫度按上述溫度，45秒，72℃，延伸45秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。采用Gel Doc XR圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。甲基化發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)分析∶甲基化率（%）＝（完全甲基化標(biāo)本數(shù)+不完全甲基化標(biāo)本數(shù)）/總標(biāo)本數(shù)×100%。MSP陽(yáng)性對(duì)照采用經(jīng)甲基化酶SssⅠ處理以后的基因組DNA進(jìn)行PCR，陰性對(duì)照采用滅菌雙蒸水代替DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為對(duì)MSP檢測(cè)的進(jìn)行質(zhì)量控制，隨機(jī)選取10%的標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)性達(dá)到95%以上。

4.RT-PCR法檢測(cè)OSCC組織中PRSS8基因mRNA表達(dá)水平：首先按TRIzol試劑說(shuō)明書提供的操作步驟提取OSCC和癌旁組織中的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其含量及純度，并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書步驟，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后以該cDNA為模板，加入反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GADPH作為內(nèi)參照。擴(kuò)增條件：95℃，預(yù)變性10分鐘，一個(gè)循環(huán)；94℃，變性，45秒；退火溫度按上述溫度，45秒；72℃，延伸45秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7min。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS statistics 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法，計(jì)量資料兩樣本間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或t'檢驗(yàn)，多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.OSCC和癌旁組織中PRSS8基因的甲基化狀態(tài)：MSP檢測(cè)結(jié)果OSCC組織PRSS8及PTPN22基因啟動(dòng)子甲基化率均明顯高于相應(yīng)正常組織（57.7%vs34.6%χ2＝5.571，P＝0.018）

2.OSCC和癌旁組織中PRSS8基因mRNA的表達(dá)情況：PRSS8基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量在OSCC組織中明顯低于相應(yīng)癌旁組織（0.44±0.12vs0.71±0.13 t＝-10.620，P＝0.000）

3.PRSS8基因啟動(dòng)子甲基化與患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系：PRSS8基因甲基化狀態(tài)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)相關(guān)（均P＜0.05）。

4.OSCC中PRSS8基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平及與臨床參數(shù)之間的關(guān)系：OSCC組織中PRSS8基因mRNA的表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)相關(guān)（均P＜0.05）。

圖1 PRSS8基因在口腔鱗癌及正常組織中的甲基化狀態(tài)

圖2 PRSS8基因和內(nèi)參mRNA在口腔鱗癌及正常組織中的表達(dá)

表2 口腔鱗癌組織和正常組織中PRSS8基因甲基化情況

表3 口腔鱗癌組織和正常組織中PRSS8 mRNA相對(duì)表達(dá)量

表4 口腔鱗癌組織中甲基化組和非甲基化組PRSS8mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

表5 PRSS8基因甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

表6 PRSS8mRNA相對(duì)表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系

討 論

PRSS8基因位于染色體16p11.2[2]，其編碼的蛋白又稱為人類的前列腺蛋白（Prostasin）或CAP-1，自1994年首次在人體精液中發(fā)現(xiàn)以來(lái)，關(guān)于PRSS8的研究日益受到重視。它是一種絲氨酸蛋白酶，長(zhǎng)度約40KDa，其編碼的蛋白廣泛分布于人類各正常組織中，尤其是上皮組織，能夠參與生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的遷移等生理及病理過(guò)程[1，2]。近些年來(lái)研究表明，PRSS8基因在胃癌[3]，乳腺癌[4]，食管癌[5]，膀胱癌[6]，前列腺癌[7，8]等諸多癌癥中表達(dá)下調(diào)，在上述癌組織等中均可以觀察到PRSS8的甲基化狀態(tài)。BAO[5]等人利用轉(zhuǎn)染技術(shù)確定PRSS8啟動(dòng)子的區(qū)中的CPG島具有生物學(xué)功能，并且這個(gè)區(qū)域的甲基化可能導(dǎo)致PRSS8表達(dá)的抑制，所以推斷食管癌癌組織中PRSS8的減少可能與PRSS8的啟動(dòng)子甲基化有關(guān)，通過(guò)對(duì)食管癌細(xì)胞使用5-氮雜胞苷（地西他濱，DAC）進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示抑制了食管癌細(xì)胞的增殖和遷移，修復(fù)后的細(xì)胞周期停滯在G1期。由此推斷PRSS8可以作為一個(gè)抑癌基因在人體內(nèi)發(fā)揮作用的。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在52例OSCC組織及相應(yīng)正常黏膜組織中，OSCC組織中的PRSS8基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的發(fā)生率顯著高于相應(yīng)正常組織甲基化發(fā)生率，提示PRSS8基因通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能是OSCC的發(fā)生機(jī)制之一。本研究的這一結(jié)果與PRSS8基因在食管鱗癌[3]等多種癌癥中的研究基本一致。此外，本此研究還檢測(cè)了52例OSCC患者中癌組織及正常組織中PRSS基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，OSCC組織中PRSS8基因的相對(duì)表達(dá)量明顯低于相應(yīng)正常組織。這一結(jié)果提示，PRSS8基因在OSCC中可能主要起抑癌基因的作用，與PRSS8在其他癌癥的研究一致。為探討OCSS中PRSS8基因表達(dá)下降是否與其啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化密切相關(guān)，進(jìn)一步比較了發(fā)生甲基化的OSCC組織與未發(fā)生甲基化的OSCC組織中PRSS8基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，甲基化組PRSS8基因mRNA相對(duì)表達(dá)量低于非甲基化組，初步證實(shí)了在OSCC中，PRSS8基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化可能是引起其mRNA相對(duì)表達(dá)降低的原因之一。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)研究了PRSS8基因甲基化率與OSCC患者臨床資料間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)52例OSCC標(biāo)本中PRSS8基因甲基化率與患者的性別、年齡、飲酒、吸煙等之間均未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與以往的研究結(jié)果有差別，以往的流行病學(xué)研究顯示，煙草、乙醇和檳榔等是口腔癌發(fā)病的化學(xué)因素，而此次的研究無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因，可能是因?yàn)闃颖玖枯^少，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)校驗(yàn)效能下降。也正因如此，本實(shí)驗(yàn)中PRSS8mRNA相對(duì)表達(dá)量與臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有待于日后擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步明確PRSS8基因甲基化及其mRNA相對(duì)表達(dá)量降低與OSCC患者飲酒、吸煙等臨床資料的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)PRSS8基因甲基化及其mRNA相對(duì)表達(dá)量降低與臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，病理分期等臨床資料呈正相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明PRSS8基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能與OSCC的預(yù)后有關(guān)。

因PRSS8參與了上皮組織的形成與粘附過(guò)程，細(xì)胞粘附分子（E-cadherin）是一種跨膜糖蛋白，分子量為124KD，主要分布于非神經(jīng)上皮組織，在維護(hù)上皮細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整性和極性中起到重要作用。

Diniz-Freitas M[9]等發(fā)現(xiàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染E-cadherin蛋白能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，推測(cè)E-cadherin表達(dá)的減少是可以作為一種惡性標(biāo)志。在分子水平，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR），E-cadherin和E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制物（如SNAIL和SLUG）已被證明在惡性膀胱癌的進(jìn)展過(guò)程中扮演了重要的作用[10]。而在慢性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)PRSS8通過(guò)激活Sphk1/S1p/Stat3信號(hào)傳導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)Stat3的持續(xù)激活更加促進(jìn)β-catenin的細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移和聚集，E-cadherin的表達(dá)下降，影響細(xì)胞的緊密連接[11]。越來(lái)越多的證據(jù)表明E-cadherin通過(guò)調(diào)控GSK3β，Snail/Slug和Akt/PKB[12～14]等信號(hào)通路的表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。E-cadherin的正常表達(dá)可以使可以阻止腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[15]。

E-cadherin的表達(dá)下調(diào)與OSCC的組織分化、侵襲和轉(zhuǎn)移能力、預(yù)后密切相關(guān)[16～18]。在今后的研究中，可應(yīng)用western-blot、基因敲除等技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證此基因與E-cadherin與OSCC的關(guān)系?？傊狙芯刻崾綪RSS8啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常高甲基化可能是導(dǎo)致OSCC中相應(yīng)基因表達(dá)降低的重要機(jī)制之一，PRSS8有可能是OSCC早期診斷的生物標(biāo)記物。