鮑 軼 莫娟芬

近年來隨著臨床影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及低劑量CT對肺癌高危人群篩查的應(yīng)用，肺部多發(fā)結(jié)節(jié)、腫塊檢出的現(xiàn)象有增多趨勢。根據(jù)2013年《新英格蘭雜志》報(bào)道，通過低劑量CT對高危人群的篩查，使肺結(jié)節(jié)的發(fā)生率由8%增加至51%，而且肺癌病死率下降20%[1]?，F(xiàn)有研究報(bào)道同時(shí)性多原發(fā)肺癌的發(fā)生率在0.2%～8.0%[2]。本文回顧高通量測序在多原發(fā)非小細(xì)胞肺癌診斷中的價(jià)值，并探討通過對多個(gè)原發(fā)癌灶全外顯子測序，對獲取非小細(xì)胞的進(jìn)化機(jī)制，為更好的解碼肺癌生物學(xué)信息奠定基因，并為預(yù)防肺癌的發(fā)生及靶向精準(zhǔn)治療，延遲患者的生存提供依據(jù)。

一、多原發(fā)肺癌的定義

多原發(fā)肺癌(MPLC)是指在同一個(gè)患者肺內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上的原發(fā)性惡性腫塊，部位可以位于同側(cè)肺或兩肺，時(shí)間上可以是同時(shí)發(fā)現(xiàn),被稱為同時(shí)性多原發(fā)肺癌(synchronous multiple primary lung cancer, sMPLC)，或者是異時(shí)檢測出且距首發(fā)肺部惡性腫塊診斷時(shí)間間隔超過2年,臨床稱為異時(shí)性多原發(fā)肺癌(meterochronous multiple primary lung cancer, mMPLC)[2]。MPLC需在術(shù)前與肺癌伴肺內(nèi)轉(zhuǎn)移做出鑒別，因?yàn)楦鶕?jù)目前TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，同肺葉的伴同時(shí)性原發(fā)衛(wèi)星結(jié)節(jié)，診斷為T4(臨床分期ⅢB期),而原發(fā)惡性腫塊在一側(cè)肺葉，而轉(zhuǎn)移病灶不同肺葉則認(rèn)為是轉(zhuǎn)移性病灶(臨床分期為Ⅳ期),這與多原發(fā)肺癌，特別是sMPLC的處理方法是完全不同的[3]。不過實(shí)際診治過程中，往往是通過手術(shù)后病理標(biāo)本的獲取，做出最終的診斷。

非小細(xì)胞肺癌是較為高發(fā)的肺癌病理類型，特別是近年來肺腺癌高發(fā)，多原發(fā)肺腺癌比例也呈現(xiàn)遞增趨勢。對于肺鱗癌，長期吸煙史是重要的發(fā)病機(jī)制，吸煙影響支氣管樹的不同敏感細(xì)胞后形成肺的浸潤性癌，可以同時(shí)或序貫發(fā)生，異時(shí)性原發(fā)性肺鱗癌的發(fā)生可能是多處肺組織因不斷暴露在吸煙等致癌性刺激下的結(jié)果[4]。目前肺腺癌的致病因素并不是很清楚，很多女性患者并沒有吸煙史，因此從分子水平研究多原發(fā)肺腺癌，不僅對于明確鑒別不同腫塊的性質(zhì)，而且可以通過分子學(xué)水平對肺內(nèi)多發(fā)性肺癌進(jìn)行研究，找到肺腺癌可能的發(fā)病機(jī)制。

二、多原發(fā)肺癌的病理學(xué)診斷

多原發(fā)肺癌需與多原發(fā)肺癌與肺癌伴肺內(nèi)轉(zhuǎn)移區(qū)分，在術(shù)前準(zhǔn)確評估。根據(jù)Martini-Melamed的診斷標(biāo)準(zhǔn)，各個(gè)癌灶間彼此孤立，包括位于不同的肺段、或肺葉，各癌灶共同引流區(qū)域無腫瘤細(xì)胞累計(jì)，且無縱膈淋巴結(jié)及無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。對于mMPLC，病理組織學(xué)類型相同時(shí)，無瘤間期至少2年，或均由不同的原位癌起源，或第2原發(fā)癌位于不同肺葉或不同側(cè)肺時(shí)，肺癌共同的淋巴引流部位無癌細(xì)胞累及，確立第2原發(fā)癌時(shí)無肺外轉(zhuǎn)移[5]。不過美國胸科醫(yī)師協(xié)會(ACCP)2013年對mMPLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)指出對于第2原發(fā)癌組織類型相同時(shí)，時(shí)間間隔需不少于4年，若時(shí)間在2～4年則不能確定是mMPLC 還是肺癌的肺內(nèi)轉(zhuǎn)移[6]。不過臨床實(shí)踐中仍然可能會存在同時(shí)或異時(shí)性原發(fā)性多難以肺癌伴肺內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)行鑒別，導(dǎo)致診斷延誤及治療方法錯(cuò)誤。近年來分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)開始從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室向臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，分子診斷學(xué)成為腫瘤診斷、預(yù)后判斷及篩選合適人群使用靶向藥物的必不可少的方法學(xué)。因此通過分析各癌灶的分子遺傳特征，幫助鑒別MPLC和肺癌伴肺內(nèi)轉(zhuǎn)移，減少誤診的發(fā)生。

三、高通量測序在多原發(fā)肺癌中的應(yīng)用

高通量測序(high-throughput sequencing)，又稱二代測序或下一代測序(next-generation sequencing technology，NGS)是近幾年來發(fā)展最為有價(jià)值的分子診斷技術(shù)之一，具有通量高、速度快、樣本量少、敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)被許多臨床實(shí)驗(yàn)室開始用于遺傳性的胚系突變(germline)和獲得性的體細(xì)胞(somatic)基因突變的檢測[7]。細(xì)胞突變檢測可包括目標(biāo)區(qū)域測序、全外顯子組(whole exome)、全基因組(whole genome)或線粒體DNA測序等，其中全外顯子測序是通過發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)功能變異直接相關(guān)的遺傳突變，因此相對于全基因組測序費(fèi)用會更低，數(shù)據(jù)更易于分析[8]。特別是針對特定疾病設(shè)定可行的目標(biāo)區(qū)域的測序基因，分析檢測某些基因存在點(diǎn)突變(single nucleotide changes)、 插入或缺失不同數(shù)目的拷貝數(shù)(insertion or deletion of varying sizes copy number variations)、 重排(translocations)等，是疾病的診斷、用藥指導(dǎo)及預(yù)后判斷更為可行方法[9]。

2016年中國臨床腫瘤學(xué)會(CSCO)發(fā)布了《二代測序技術(shù)臨床應(yīng)用共識》，通過國內(nèi)臨床腫瘤學(xué)專家、生物信息學(xué)專家、病理學(xué)家等多個(gè)領(lǐng)域?qū)＜遥瑢GS的技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀、檢測內(nèi)容、樣本處理、測序流程、數(shù)據(jù)管理、信息學(xué)分析、結(jié)果報(bào)告解釋等多個(gè)方面內(nèi)容進(jìn)行了詳細(xì)的闡述,這對臨床規(guī)范和有效應(yīng)用高通量測序有著重要意義[10]。根據(jù)中國臨床腫瘤學(xué)會《二代測序技術(shù)臨床應(yīng)用共識》，目前肺癌推薦需要檢測的基因包括表皮生長因子受體(EGFR)、kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(K-RAS)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、c-ros肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ROS1)、間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)移因子(MET)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(BRAF)。

前期筆者對多例臨床存在多個(gè)癌灶肺癌的患者進(jìn)行術(shù)后病理組織分子診斷分析，通過采用Illumina公司設(shè)計(jì)并商品化的TruSight Tumor 15(美國Illumina Inc公司)，檢測甲醛固定的石蠟包埋(FFPE)腫瘤組織中15種常見基因突變，除了ALK，TruSight Tumor 15包括了中國臨床腫瘤學(xué)會要求的肺癌做的全部基因以及P53,通過分析各癌灶的分子遺傳特征，可以作為病理診斷的輔助手段，幫助區(qū)分與肺癌伴肺內(nèi)轉(zhuǎn)移之間的差異，減少誤診的發(fā)生。而EGFR對亞洲人群來說可能是最重要的分子生物學(xué)標(biāo)志物之一來鑒別多原發(fā)肺癌，而最近的一項(xiàng)來自中國的研究，通過分析多發(fā)磨玻璃樣肺癌結(jié)節(jié)中EGFR18-21號外顯子熱點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)38個(gè)配對樣本中EGFR突變的差異率在92.1%[11]。而另一項(xiàng)研究入組了37例多發(fā)肺癌手術(shù)患者，根據(jù)Martini-Melamed診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷多原發(fā)肺癌或肺癌伴肺內(nèi)轉(zhuǎn)移，對配對樣本采用二代測序，通過選擇20個(gè)與肺癌密切相關(guān)的基因進(jìn)行檢測，對臨床病理無法判斷肺癌伴肺內(nèi)轉(zhuǎn)移，通過配對癌灶組織基因組突變分析，由于存在多個(gè)基因相同突變而診斷為肺癌伴肺內(nèi)轉(zhuǎn)移，因此認(rèn)為高通量測序可以作為傳統(tǒng)病理診斷有益的補(bǔ)充[12]。不過對于多原發(fā)肺癌可行的目標(biāo)區(qū)域測序的基因組的選擇，找到較為全面并符合特定人群的基因組，用于幫助MPLC診斷，還需要后續(xù)更多大樣本的深入研究及共識討論[13]。

四、多原發(fā)肺癌生物學(xué)信息分析對解碼肺癌進(jìn)化機(jī)制的研究

實(shí)際上多原發(fā)肺癌進(jìn)化及各克隆灶的形成是一個(gè)長期復(fù)雜的過程，理論上多原發(fā)肺癌的克隆性形成一般是基于癌基因或抑癌基因發(fā)生體細(xì)胞突變，如P53點(diǎn)突變、X染色體失活分析或雜合性丟失(LOH)等。因此應(yīng)該存在某一個(gè)或多個(gè)基因標(biāo)志物，獨(dú)立且突變率發(fā)生較高，并且出現(xiàn)較早且貫穿于整個(gè)過程，而在肺癌進(jìn)化過程中各克隆產(chǎn)生了不同的體細(xì)胞突變。由于抑癌基因P53的突變在肺癌中十分常見，且大多是點(diǎn)突變，在非小細(xì)胞肺癌中(NSCLC)高達(dá)50%，可能符合多原發(fā)肺癌標(biāo)志物的要求[14,15]。另外，X染色體基因失活(X-inactivation)也可用于檢測克隆與腫瘤間的聯(lián)系，不過這種技術(shù)僅用于女性患者[16]。雜合性丟失(LOH)為一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)從種系雜合性到純合性的轉(zhuǎn)變，喪失一個(gè)等位基因標(biāo)志。LOH分析方法是依靠單核苷酸多態(tài)性和微衛(wèi)星基因型的比較或腫瘤DNA樣本和病例匹配正常非瘤組織中獲取DNA樣本的比較[17]。2017年在《新英格蘭雜志》發(fā)表了一項(xiàng)大樣本的非小細(xì)胞肺癌(可切除的ⅠA至ⅡA期NSCLC患者)的研究報(bào)道，通過對327個(gè)區(qū)域進(jìn)行了全外顯子組測序發(fā)現(xiàn) EGFR、MET和BRAF突變大部分屬于早期突變和克隆性突變，而參與DNA損傷修復(fù)等維持基因組完整性的基因，如PIK3CA、NF1、TP53和Notch在75%以上的腫瘤發(fā)生突變，并且時(shí)間軸上發(fā)生較晚，另外CDK4、FOXA1和BCL11A的擴(kuò)增，基因拷貝數(shù)的異常導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性，這與腫瘤復(fù)發(fā)有著重要的相關(guān)性[18]。筆者前期通過1例確診為早期多原發(fā)肺腺癌的患者，去除胚系突變后發(fā)現(xiàn)不同的癌灶中均表達(dá)較高突變率的ERG同位點(diǎn)突變。ERG 屬于ETS家族融合基因，而 ETS-相關(guān)基因?qū)儆贓-26轉(zhuǎn)化(ETS)家族的轉(zhuǎn)錄因子, ERG融合基因激活是引起前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展最為普遍的基因改變，而早期腫瘤中高頻率的ERG突變，可能提示多克隆灶在肺癌早期在相同的致癌環(huán)境，產(chǎn)生了某一個(gè)或多個(gè)基因的高頻點(diǎn)突變[19]。因此通過全外顯子測序，對肺癌克隆的進(jìn)化機(jī)制的闡明，起著關(guān)鍵作用，而通過多原發(fā)肺癌各配對癌癥進(jìn)行二代測序研究無疑對肺癌的發(fā)生的異質(zhì)性、演變、治療及耐藥等均具有重要意義。鑒于目前無大樣本后續(xù)研究，這將是今后研究熱點(diǎn)之一。

綜上所述， MPLC 與肺癌伴肺內(nèi)轉(zhuǎn)移在臨床治療及預(yù)后有顯著不同，需要在術(shù)前和術(shù)后做出準(zhǔn)確判斷。對于高通量測序臨床使用，可以獲取不同腫塊的分子病理信息，作為“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”手段可用于輔助傳統(tǒng)的病理組織學(xué)診斷。通過深入研究，后續(xù)用于MPLC診斷的高通量測序基因組將會有統(tǒng)一的指導(dǎo)意見，并應(yīng)用于臨床實(shí)踐。