陳為凱 張亞男 于建平 汪文杰 余穩(wěn)穩(wěn) 徐子鵬 韓博強 劉宏斌

胃癌(gastric cancer，GC)是全球第二大癌癥相關死亡原因,占全球惡性腫瘤死亡人數(shù)的8.8%[1]。在中國，2014年GC的病死率為21.48/105，約29.4萬人，位居第3位[2]。亞洲是GC高發(fā)地區(qū)，最新數(shù)據(jù)顯示，在2000～2014年我國GC5年生存率仍低于40%[3]。隨著基因芯片技術的廣泛應用，人類基因組中僅不到2%的基因具有編碼功能，非編碼基因已獲得廣大專家學者的高度重視。非編碼微小RNA(micro noncoding RNA，miRNA)和長鏈非編碼RNA(long nocoding RNA，lncRNA)已成為腫瘤領域的研究焦點。近年來，多項研究表明，二者不僅分別在腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其間還存在諸多交叉調控。為探討lncRNA與miRNA相互調控作用及其在GC中的影響，通過查閱文獻，現(xiàn)綜述如下。

一、lncRNA與miRNA的相互調控作用

1.miRNA促進lncRNA的衰減：在細胞中，miRNA可靶向調控lncRNA，通過降低lncRNA的穩(wěn)定性而造成其衰減。眾所周知，miRNA是通過與其靶基因直接結合，進而誘導靶基因降解和(或)抑制其翻譯過程。Chen等[4]研究表明，在食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中，lncRNA-let與miR-548k的表達呈負相關,miR-548k可直接靶向抑制lncRNA-let的表達，進一步下調p53和上調NF90的表達。miR-548k的高表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期及患者生存率顯著相關。miR-548k能促進體外培養(yǎng)的ESCC細胞增殖和遷移，促進腫瘤的體內生長，而miR-548k對ESCC的影響則依賴于其對lncRNA-let的直接結合并抑制lncRNA-let的表達。同樣在ESCC中，Wang等[5]利用RNA純化-qPCR法分離染色質，發(fā)現(xiàn)miR-196A能與lncRNA Gas5結合。同時熒光素酶報告分析表明miR-196A可與lncRNA Gas5的第7外顯子結合，且Gas5和miR-196A都能與RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)的關鍵成分Ago 2結合。提示Gas5在ESCC中起抑癌基因的作用，并受miR-196A參與RISC的調控。在此之前，多項研究證明在各種病理生理過程中均存在miRNA誘導的lncRNA表達抑制，包括lncRNA p21、lncRNA HOTAIR、lncRNA MALAT1、lncRNA LOC85194、lncRNA PTTCC3及l(fā)ncRNA H19等，提示miRNA對lncRNA的抑制機制可能是廣泛存在的[6～8]。

2.lncRNA作為miRNA海綿/誘餌:與編碼RNA共享miRNA反應元件(microRNA response elements，MRE)的lncRNA可能存在類似的miRNA靶向序列，競爭性抑制miRNA與mRNA間的相互作用。這些lncRNA被稱為競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，可以作為miRNA的“海綿”或“誘餌”，減少可用miRNA的數(shù)量，并有利于提高目標mRNA的翻譯。近來，Zhou等[9]在探索lnc HAND 2-AS1在結直腸腫瘤性疾病的作用時，通過生物信息學方法發(fā)現(xiàn)lnc HAND 2-AS1與miR-1275形成互補堿基。在HCT116細胞系中，lnc HAND 2-AS1過表達可明顯抑制miR-1275的表達。此外，miR-1275的高表達抑制了lnc HAND 2-AS1的表達，而抑制miR-1275的表達則促進了HCT 116細胞lnc HAND 2-AS1的表達。為驗證lnc HAND 2-AS1是否與miR-1275相互作用，研究者其采用熒光素酶報告法，發(fā)現(xiàn)轉染miR-1275可以降低pmirGLO-HAND 2-AS1-WT在HCT 116細胞中的熒光素酶強度。此外，qRT-PCR分析顯示lnc HAND 2-AS1與miR-1275在大腸癌組織中的表達呈負相關。此研究表明lnc HAND 2-AS1在結直腸腫瘤細胞中中充當miR-1275海綿。Wang等[10]也使用類似實驗方法發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOXA-AS2同樣作為ceRNA調控miR-520c-3p的表達。

3.lncRNA/miRNA與mRNA的競爭性結合:非編碼RNA的調控機制與蛋白質編碼RNA一樣復雜。一方面，非編碼RNA可能受到多種機制的調控，如基因突變、DNA拷貝的改變、轉錄缺陷和表觀遺傳改變等。例如，lnc BACE1AS可以與miR-485-5p競爭，通過拮抗miR-485-5p誘導的mRNA降解來抑制lnc BACE 1的表達下降[11]。同樣，在使用抗腫瘤藥抑制宮頸癌HELA細胞內源性let-7i后，另一種lncRNA Hox反義RNA(HOX antisense intergenic RNA，HOTAIR)仍是富集、穩(wěn)定的[12]。Franklin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼N-ras功能性RNA(NCNRFR)可與let-7競爭性結合含有l(wèi)et-7位點的mRNA，同時也逆轉了let-7對mRNA的抑制作用。Faghihi等[14]在β-淀粉樣前體蛋白切割酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，Bace 1)的mRNA中發(fā)現(xiàn)了一個miR-485-5p結合位點，lnc Bace 1反轉錄本通過與miR-485-5p競爭性結合Bace 1從而阻止miRNA抑制Bace 1。

4.部分miRNA由lncRNA產(chǎn)生:曾有研究報道,lnc MD1可分別從內含子和外顯子生成miR-206和miR-133[15]。同時，lnc H19已被證實能在小鼠體內產(chǎn)生miR-675[16]。

二、lncRNA與miRNA間相互作用對GC的影響

lncRNA和miRNA間的相互調控參與著腫瘤性疾病的各個病理生理過程。這里，將根據(jù)現(xiàn)有的lncRNA的主要類型，概述lncRNA-miRNA在GC發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用。

1.H19：H19是最早報道的印記基因之一，最初，人們發(fā)現(xiàn)H19在胚胎中有較高水平的表達，其在進化過程中的高度保守性表明其一定具有重要作用。H19是一個2.3kb的lncRNA，由位于人類染色體11p15.5上的H19/Igf 2基因簇轉錄而成[17]。H19最初被認為具有抑制腫瘤的能力，經(jīng)過一系列研究證實，H19被確認為致癌調節(jié)因子，在膀胱癌、乳腺癌和結直腸癌等各種惡性腫瘤疾病中均有明顯的過表達，H19可能是腫瘤細胞或組織特異性基因，但其作為腫瘤進展的作用是抑制或促進仍有爭議[18,19]。

Liu等[20]在一系列研究中發(fā)現(xiàn)，H19依賴于miR-675來增強GC AGS細胞的增殖和侵襲，并且miR-675的表達與GC患者中的H19呈正相關。隨后，腫瘤抑制基因結構域轉錄因子1(RUNX1)被證實是H19/miR-675軸的下游分子，因為H19或miR-675的過表達顯著降低了AGS細胞中的RUNX1表達，并且敲除了H19或miR-675后RUNX1表達量增高。更重要的是，Liu進一步證明RUNX1的引入抑制了H19/miR-675誘導的AKT/mTOR途徑的激活。研究者認為，RUNX1是H19/miR-675軸與AKT/mTOR信號通路之間聯(lián)系的關鍵分子，并且H19/miR-675誘導的GC進展中的關鍵介質。同樣，Yan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，作為miR-675的前體，H19/miR-675軸通過FADD/caspase-8/caspase-3信號通路促進了GC的發(fā)生、發(fā)展。 在GC細胞株SGC-7901和MKN 45中，Zhou等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miR-141通過與H19結合而抑制其的表達，進而導致H19的降解。miR-141高表達后，包括miR-675、IGF1和IGF2在內的H19靶點均呈下降趨勢。同時，H19還對miR-141的靶基因Drosha、Dicer以及zeb 1進行了調控。關于H19臨床意義和作用機制多種多樣，諸多研究表明H19在不同水平上可能有助于評估GC患者的死亡風險，H19有望成為GC治療的靶點。

2.HOTAIR:HOTAIR是一種已知的含有2158個核苷酸的lncRNA，它不編碼任何蛋白質，而是通過改變染色質結構在基因調控中發(fā)揮重要作用。HOTAIR被認為與多種人類腫瘤性疾病有關，它的高表達可以促進包括GC在內大多數(shù)腫瘤的侵襲和轉移等病理生理過程[23]。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，GC組織HOTAIR的表達量較高，miR-217表達量較低，且miR-217的低表達及HOTAIR的高表達與GCTNM分期相關。同時，miR-217的表達與HOTAIR表達呈負相關。 HOTAIR的異常表達促進了GC細胞增殖和遷移，抑制了miR-217表達并增強了GPC5和PTPN14的表達。此外，研究者還證明了HOTAIR的過表達提高了GC細胞紫杉醇和阿霉素的耐藥，miR-217的過表達則相反。這些數(shù)據(jù)表明HOTAIR的過表達通過抑制miR-217表達從而增強了GC細胞中的紫杉醇和阿霉素的耐藥。Cheng等[25]同樣發(fā)現(xiàn)在GC細胞中，HOTAIR可直接與miR-34a結合并通過PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號通路調控GC細胞的順鉑耐藥性。

3.MEG 3:lncRNA MEG 3位于人類染色體14q32.3上，是一種在許多正常組織中表達的lncRNA。然而，在許多腫瘤和腫瘤衍生細胞系中，它經(jīng)常丟失、突變或降低。適當恢復MEG 3表達水平可以抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡和自噬[26]。這些發(fā)現(xiàn)提示MEG 3是具有抑癌活性的lncRNAs之一。Dan等[27]在GC組織和細胞系(MKN74、MKN45、SGC7901、AGS)中觀察到MEG 3表達量較低。Dan通過pcDNA3.1-MEG 3轉染過表達的MEG 3顯著抑制了GC細胞的細胞增殖、遷移和侵襲。生物信息學預測揭示MEG 3和miR-21之間存在靶向關系。在GC組織和細胞系中觀察到過表達的miR-21。熒光素酶報告測定的結果表明miR-21是MEG 3的靶基因，并且實時熒光定量PCR的結果表明miR-21的表達受MEG 3的負調節(jié)。此外，過表達的miR-21可促進細胞增殖和轉移。然而，pcDNA3.1-MEG 3轉染可以抵消miR-21模擬物對GC細胞增殖和轉移的促進作用，表明MEG 3通過抑制miR-21表達影響GC細胞的增殖和轉移。最后，小鼠腫瘤模型實驗表明，過表達的MEG 3還可以通過抑制miR-21的表達來抑制體內腫瘤的生長和轉移。Dan的研究揭示了MEG 3/miR-21軸在GC進展中的調節(jié)作用，并為GC治療提供了新的潛在治療策略。2015年，Peng等[28]經(jīng)研究證實，在GC組織中MEG 3的表達水平與正常組織比較降低并與GC患者密切相關，MEG 3作為ceRNA競爭結合miR-181a調控Bcl-2的表達從而抑制GC細胞的增殖、遷移和侵襲。

4.GAPLINC:GAPLINC是一種新發(fā)現(xiàn)的924bp的lncRNA，通過轉錄起始位點數(shù)據(jù)庫預測其啟動子區(qū)域含有MRE。Diao等[29]在GC組織中發(fā)現(xiàn)GAPLINC和MAPK 1之間存在顯著的正相關關系。GAPLINC依賴于MAPK 1從而對GC細胞增殖和細胞周期的促進作用。最后，Diao等[29]首次證明了GAPLINC充當miR-378分子海綿，從而促進了MAPK 1的表達。

5.NNT-AS1:lncRNA NNT-AS1在多類腫瘤中具有癌基因的作用，調控腫瘤細胞的侵襲、轉移、耐藥等多種病理生理過程。近來，Chen等[30]深入地研究了NNT-AS1在GC發(fā)生中的生物學作用。結果表明，與癌旁正常組織和正常細胞系比較，GC組織和細胞系中NNT-AS1的表達水平明顯上調。NNT-AS1異位高表達提示GC患者預后不良。體外實驗證實，NNT-AS1基因敲除抑制了GC細胞的增殖和侵襲能力，誘導GC細胞周期阻滯于G0/G1期。在體內異種移植實驗中，NNT-AS1沉默抑制了GC細胞的生長。生物信息學在線程序預測miR-424的目標是NNT-AS1的3′UTR。Chen通過熒光素酶報告法、RNA免疫沉淀法(RIP)和RNA下拉法證實了NNT-AS1和miR-424之間的分子結合，從而共同形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)。證實了E2F1是NNT-AS1/miR-424的靶基因，NNT-AS1以“海綿”的形式作用于miR-424/E2F1從而促進了GC的發(fā)生和發(fā)展進程。

6.BLACAT1:lncRNA膀胱癌相關轉錄物-1(bladder cancer associated transcript-1，BLACAT1)，又被稱為lnc UBC 1，位于人類染色體1q32.1上，其轉錄本為2616kb，只有一個外顯子，首次被報道為與膀胱癌淋巴結轉移和預后負相關。Wu等[31]研究了BLACAT1在GC化學治療耐藥中的作用和潛在調節(jié)機制。結果顯示，與奧沙利鉑敏感GC組織和親代細胞系比較，奧沙利鉑抗性GC組織和細胞中BLACAT1表達上調。在體外，BLACAT1敲除降低了耐藥相關基因和ABCB1蛋白的表達水平。此外，BLACAT1敲除顯著促進細胞凋亡、侵襲和奧沙利鉑的IC50值。在體內，敲出BLACAT1可抑制GC細胞的生長。生物信息學工具和熒光素酶測定表明，miR-361均可與BLACAT1和mRNA ABCB1的3′-UTR特異性結合，發(fā)現(xiàn)了BLACAT1/miR-361/ABCB1調節(jié)途徑。其研究結果表明，BLACAT1可通過靶向調控miR-361促進ABCB1蛋白表達，加速了奧沙利鉑對GC的耐藥性，為GC的化學治療耐藥提供了新的見解。

三、展 望

綜上所述，非編碼RNA作為多水平調控基因表達的中心分子，可以影響細胞分裂、增殖、分化、衰老和凋亡等各個方面。非編碼RNA調控異常參與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展，通過與其他轉錄因子的相互作用，形成一個復雜的調控網(wǎng)絡。隨著腫瘤的發(fā)展，不同種類的非編碼RNA，特別是lncRNA和miRNA之間的相互作用也逐漸顯現(xiàn)出來。本文綜述了GC中l(wèi)ncRNA與miRNA之間的相互調控機制，著重討論了它們在GC發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。上述研究表明，lncRNA可以通過多種轉錄后機制充當miRNA的調控者或效應者，共同調控基因表達，最終影響GC的進展。雖然現(xiàn)有研究對非編碼RNA的探索已經(jīng)取得了巨大進展，但筆者對GC中l(wèi)ncRNA-miRNA相互作用機制的了解還不夠充分，還需要在以下幾方面進行更深入的探索：(1)深度分析國內外相關數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，充分利用生物信息學技術，進一步揭示lncRNA-miRNA調控網(wǎng)絡的生物學意義。(2)加強實施大樣本動物實驗研究，推進lncRNA-miRNA調控網(wǎng)絡的實際應用。(3)對lncRNA相關miRNA進行系統(tǒng)分析，充分闡明lncRNA-miRNA調控網(wǎng)絡。lncRNA-miRNA調控網(wǎng)絡的明確或許可為GC提供全新的臨床診療策略。