陸 剛 張 羽 張學(xué)敏

膿毒癥(sepsis)是指由細(xì)菌或真菌等病原體毒素釋放并引發(fā)全身炎癥綜合反應(yīng)的病癥，并以機體免疫系統(tǒng)激活并活化多種炎性因子進(jìn)而導(dǎo)致組織器官、免疫系統(tǒng)等發(fā)生損害為主要病理特征[1]。其發(fā)病機制尚未完全闡明。研究顯示膿毒癥可進(jìn)一步發(fā)展為重癥膿毒癥或多器官功能障礙綜合征(MODS)，甚至膿毒癥休克，而MODS等引發(fā)機體處于應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生[2]。因而探尋預(yù)測膿毒癥發(fā)展為應(yīng)激性潰瘍的相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)對延緩或控制病情發(fā)展具有重要意義。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)可調(diào)節(jié)多種生物病理生理過程并參與機體炎性反應(yīng)或腫瘤形成過程[3]。機體特異性/非特異性免疫過程中Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)充當(dāng)重要蛋白分子，可識別病原相關(guān)分子模式的受體，同時TLRs介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對機體調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)發(fā)揮重要作用[4]。關(guān)于HMGB1、TLRs在膿毒癥發(fā)生應(yīng)激性潰瘍過程中的作用研究尚未見報道，因此本研究主要探討膿毒癥患者外周血HMGB1、Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)水平與應(yīng)激性潰瘍的相關(guān)性，為臨床早期預(yù)測應(yīng)激性潰瘍提供參考依據(jù)。

資料與方法

1.一般資料:選取2016年8月～2017年4月筆者醫(yī)院收治的62例膿毒癥患者與71例嚴(yán)重膿毒癥患者作為研究對象并分別設(shè)為膿毒癥組與嚴(yán)重膿毒癥組，且均分別符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5,6]。膿毒癥組中男性34例，女性28例，患者年齡為42～72歲，平均年齡63.25±10.54歲，嚴(yán)重膿毒癥組中男性32例，女性39例，患者年齡為42～73歲，平均年齡64.13±10.69歲。入院后根據(jù)所有患者臨床資料與多器官功能障礙綜合征(MODS)評分，將患者發(fā)生應(yīng)激性潰瘍作為陽性組(76例)，未發(fā)生應(yīng)激性潰瘍作為陰性組(57例)[7]。另選取同期健康體檢志愿者58例為對照組，其中，男性30例，女性28例，年齡為40～71歲，平均年齡62.34±10.39歲。各組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：近期未服用影響免疫功能藥物者；未患有血液疾病者；受試者知情且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：自身免疫異常性疾病者；合并冠心病等嚴(yán)重疾病患者；合并其他惡性腫瘤患者；慢性肝臟、腎臟疾病終末期患者；臨床資料不全者。

2.方法：(1)制備外周血單個核細(xì)胞：無菌條件下采集受試者清晨空腹外周靜脈血3ml，并置于EDTA抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，并以3000r/min轉(zhuǎn)速離心20min，將分離得到的PBMC置于-20℃冰箱中保存待用。(2)實時熒光定量PCR法檢測外周血HMGB1、TLR2與TLR4表達(dá)量：采用Trizol試劑盒(北京百泰克公司)提取PBMC總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。運用Primer 4.1引物設(shè)計軟件HMGB1引物序列，TLR2與TLR4引物詳見表1。實時熒光定量PCR按照SYBR Green Master(德國Qiagen公司)說明書操作，每組樣品設(shè)3個復(fù)孔并置于實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，程序為95℃預(yù)變性1min，95℃ 15s，60℃ 60s，共40個循環(huán)，HMGB1、TLR2、TLR4均以GADPH為內(nèi)參基因，并采用2-ΔΔCt算法計算HMGB1、TLR2、TLR4相對表達(dá)量。(3)檢測病情相關(guān)指標(biāo):抽取所有膿毒癥患者空腹靜脈血3ml，離心后吸取血清并采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELSA)試劑盒檢測白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、炎性介質(zhì)降鈣素原(PCT)，所用儀器為美國Bio Tek全自動熒光酶標(biāo)免疫測定儀。采用放射免疫法檢測患者血清胃泌素(GAS)，并按照試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)操作，對所有患者均進(jìn)行急性生理學(xué)及慢性健康狀況評分(APACHEⅡ)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

結(jié) 果

1.3組受試者外周血HMGB1、TLRs表達(dá)量比較:膿毒癥組患者外周血HMGB1、TLR2、TLR4水平均顯著高于對照組(P<0.05)，嚴(yán)重膿毒癥組患者外周血HMGB1、TLR2、TLR4水平均顯著高于膿毒癥組(P<0.05)，詳見表2。

表2 3組受試者外周血HMGB1、TLRs表達(dá)量比較

與對照組比較，*P<0.05；與膿毒癥組比較，#P<0.05

2.陽性組與陰性組患者外周血HMGB1、TLRs表達(dá)量比較:陽性組患者外周血HMGB1、TLR2、TLR4水平顯著高于陰性組(P<0.05)，詳見表3。

表3 陽性組與陰性組患者外周血HMGB1、TLRs表達(dá)量比較

3.陽性組、陰性組患者臨床指標(biāo)的比較:觀察并比較陽性與陰性組患者臨床指標(biāo)，陽性組前炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8與氧化應(yīng)激指標(biāo)NO、MDA及PCT、hs-CRP、GAS水平及APACHEⅡ評分均顯著高于陰性組(P<0.05)，而SOD水平顯著低于陰性組(P<0.05)，詳見表4。

4.Logistic分析膿毒癥患者發(fā)生應(yīng)激性潰瘍的相關(guān)因素:將影響膿毒癥患者發(fā)生應(yīng)激性潰瘍的因素進(jìn)行Logistic分析，膿毒癥患者外周血HMGB1、TLR2與TLR4水平是膿毒癥患者發(fā)生應(yīng)激性潰瘍的獨立影響因素，詳見表5。

5.ROC分析HMGB1、TLRs對應(yīng)激性潰瘍的診斷價值:ROC分析檢測HMGB1、TLRs水平對應(yīng)激性潰瘍的診斷價值，HMGB1的敏感度為71.05%、 特異性為91.23%、截斷值為3.86；TLR2的敏感度為73.68%、特異性為73.68%、截斷值為3.87；TLR4的敏感度為65.79%、特異性87.72%、截斷值為4.63，詳見圖1、表6。

表4 陽性組、陰性組患者臨床指標(biāo)的比較

表5 膿毒癥患者發(fā)生應(yīng)激性潰瘍的相關(guān)因素的Logistic分析

圖1 膿毒癥患者外周血HMGB1、TLRs對應(yīng)激性潰瘍的ROC分析

表6 膿毒癥患者外周血HMGB1、TLRs對應(yīng)激性潰瘍的ROC分析

檢測指標(biāo)AUC標(biāo)準(zhǔn)誤Z95% CIPHMGB10.8660.03111.872 0.796～0.9190.000TLR20.7650.0416.505 0.684～0.8340.000TLR40.8110.037 8.3010.734～0.8730.000

討 論

膿毒癥主要是指損傷或感染引起宿主發(fā)生免疫及炎性反應(yīng)，嚴(yán)重時可引發(fā)多器官功能障礙甚至應(yīng)激性潰瘍[8]。機體內(nèi)炎癥或氧化應(yīng)激反應(yīng)可損害細(xì)胞對氧的利用效率并對組織器官造成損傷[9]。目前關(guān)于膿毒癥發(fā)生機制尚未完全闡明，以往研究報道指出HMGB1與晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)及TLRs可參與炎性疾病發(fā)生過程并發(fā)揮致炎作用[10～12]。本研究將通過檢測膿毒癥患者外周血HMGB1與TLRs水平并探究其與應(yīng)激性潰瘍發(fā)生的關(guān)系，為進(jìn)一步明確膿毒癥發(fā)病機制提供參考依據(jù)。

HMGB1作為炎性因子可參與體內(nèi)炎性反應(yīng)，HMGB1與受體RAGE/TLRs結(jié)合是引發(fā)炎癥疾病的重要通路[13]。核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)可在應(yīng)激性與炎性反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要功能，研究表明HMGB1與受體結(jié)合可活化NF-κB信號通路并促進(jìn)炎性因子合成及釋放進(jìn)而參與多種組織器官病理及生理過程[14]。本研究結(jié)果顯示膿毒癥組患者外周血HMGB1水平明顯升高，且嚴(yán)重膿毒癥組顯著高于膿毒癥組，陽性組顯著高于陰性組，說明膿毒癥患者HMGB1水平顯著升高且隨病情加重其表達(dá)水平升高更顯著。NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化后可促進(jìn)炎性因子表達(dá)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生進(jìn)而促進(jìn)疾病發(fā)展，而GAS水平可反映機體應(yīng)激狀態(tài)并可作為應(yīng)激性潰瘍發(fā)生的重要指標(biāo)[15～17]。本研究結(jié)果顯示陽性組IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8與NO、MDA、PCT、hs-CRP、GAS水平均顯著高于陰性組，而SOD水平顯著降低，提示膿毒癥患者外周血HMGB1水平升高可影響前炎因子與氧化應(yīng)激指標(biāo)等表達(dá)水平進(jìn)而參與膿毒癥進(jìn)展為應(yīng)激性潰瘍的過程。

TLRs家族中TLR2、TLR4位于細(xì)胞表面并可引發(fā)機體免疫過度反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致感染性與慢性炎性疾病的發(fā)生，現(xiàn)多以TLR2、TLR4作為防治疾病的重要靶點。TLR2、TLR4可加快心肌收縮性有關(guān)炎性蛋白分泌并引發(fā)充血性心力衰竭等疾病。研究表明TLR2、TLR4均可識別脂多糖并引發(fā)機體炎性反應(yīng)并促進(jìn)疾病發(fā)展進(jìn)程[18]。本研究結(jié)果顯示膿毒癥組患者外周血TLR2、TLR4水平均顯著高于對照組，嚴(yán)重膿毒癥組顯著高于膿毒癥組，進(jìn)一步分析顯示陽性組顯著高于陰性組，說明膿毒癥與應(yīng)激性潰瘍患者外周血TLR2、TLR4水平均顯著升高且隨著疾病嚴(yán)重程度的增加而顯著升高。

本研究分析應(yīng)激性潰瘍患者臨床指標(biāo)的變化，結(jié)果顯示陽性組IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、NO、MDA、PCT、hs-CRP、GAS水平及APACHEⅡ評分均顯著高于陰性組，而SOD水平顯著低于陰性組，提示HMGB1與受體TLR2、TLR4結(jié)合并激活NF-κB信號通路而促使炎性因子等分泌增加進(jìn)而在膿毒癥發(fā)生及應(yīng)激性潰瘍發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。同時Logistic分析顯示膿毒癥患者外周血HMGB1、TLR2與TLR4水平是發(fā)生應(yīng)激性潰瘍的獨立影響因素，并將影響膿毒癥發(fā)展為應(yīng)激性潰瘍的獨立影響因素進(jìn)行ROC分析，結(jié)果顯示HMGB1、TLR2、TLR4均具有較高的敏感度與特異性，提示HMGB1、TLR2與TLR4均可作為應(yīng)激性潰瘍的預(yù)測因子。本研究結(jié)果揭示外周血HMGB1、TLR2與TLR4水平升高與膿毒癥患者應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生密切相關(guān)，且均可參與疾病發(fā)生、發(fā)展并可作為預(yù)測膿毒癥患者病情的重要指標(biāo)。

綜上所述，外周血HMGB1、TLR2與TLR4水平高低可能成為膿毒癥疾病嚴(yán)重程度及應(yīng)激性潰瘍發(fā)生的重要指標(biāo)，為臨床對應(yīng)激性潰瘍的預(yù)測提供依據(jù)。