余 良，宋瑞鵬，孟凡征，劉連新

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝臟外科，哈爾濱 150001)

肝細(xì)胞癌(hepatocarcinoma,HCC)是源自肝細(xì)胞的原發(fā)性肝癌，占所有原發(fā)性肝癌的85%～90%，是男性的第五大常見癌癥，也是世界上女性的第七大常見癌癥[1]。估計(jì)每年新發(fā)病例數(shù)約為78.2萬例，每年造成60萬人死亡，其病死率高和生存時(shí)間短導(dǎo)致嚴(yán)重的全球健康負(fù)擔(dān)[1]。HCC的發(fā)生是遺傳以及環(huán)境因素相互作用的復(fù)雜過程，其機(jī)制尚未完全闡明，重要的危險(xiǎn)因素包含慢性病毒性肝炎、肝硬化、黃曲霉毒素等環(huán)境毒素，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)、飲酒、吸煙和飲食因素等生活方式因素[2]。各種HCC相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因子能夠造成DNA損傷，損傷的DNA若未及時(shí)正確修復(fù)可導(dǎo)致基因改變和基因組不穩(wěn)定，被逐漸認(rèn)為是人類HCC的共同特征。DNA損傷修復(fù)過程失調(diào)與肝癌易感性相關(guān)，并且該過程在HCC細(xì)胞中往往增強(qiáng)，導(dǎo)致針對(duì)HCC細(xì)胞的抗癌治療效果不甚理想[3]?，F(xiàn)就DNA損傷修復(fù)在HCC發(fā)生、發(fā)展及治療過程中的作用進(jìn)行綜述。

1 DNA的損傷修復(fù)過程

DNA損傷修復(fù)的失調(diào)是HCC發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。在肝細(xì)胞內(nèi)，從最基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的堿基損傷到磷酸二酯鍵的斷裂，構(gòu)成DNA的結(jié)構(gòu)都可能發(fā)生損傷，包括堿基突變、核苷酸缺失、插入、雙鏈斷裂等[4]。外源性理化因素，機(jī)體正常代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的活性氧和活性氮，甚至機(jī)體自發(fā)的水解反應(yīng)都可能造成DNA損傷[5]。正常生物體有相對(duì)完善的DNA損傷修復(fù)機(jī)制來修復(fù)由各種原因引起的DNA損傷，為了避免DNA損傷導(dǎo)致潛在的突變情況，細(xì)胞會(huì)通過某些反應(yīng)修復(fù)損傷或激活程序性凋亡：①修復(fù)DNA損傷并恢復(fù)DNA雙鏈連續(xù)性；②激活DNA損傷檢查點(diǎn)，阻止細(xì)胞周期進(jìn)展，以避免受損染色體的復(fù)制；③轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；④細(xì)胞凋亡途徑，消除嚴(yán)重受損或嚴(yán)重失調(diào)的細(xì)胞。DNA損傷修復(fù)方式包括核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)、同源重組修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)。損傷發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)損傷受體如毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變蛋白(ataxia telangiectasia-mutated protein，ATM)和Rad3相關(guān)蛋白以及Rad9-Rad1-Hus1蛋白質(zhì)復(fù)合體等率先進(jìn)行DNA損傷檢測(cè)，隨即啟動(dòng)檢驗(yàn)點(diǎn)激酶1和2以及細(xì)胞周期調(diào)控因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)；后者進(jìn)而通過激活p53并抑制細(xì)胞周期依賴性激酶實(shí)現(xiàn)G1、S、G2/M期細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞在成功修復(fù)后得以重新進(jìn)入細(xì)胞周期。一旦細(xì)胞中的DNA無法被修復(fù)，此時(shí)細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入凋亡通路，引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行自我凋亡，以防止DNA的相關(guān)損傷向子代進(jìn)行傳遞[6]。

2 肝癌致病因素與DNA損傷修復(fù)

目前肝癌的病因尚未完全明確，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子層面對(duì)肝癌的致病機(jī)制進(jìn)行了深入研究，初步揭示了各種肝癌的致病因素(如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、膽汁酸、黃曲霉菌素等)在不同水平上造成不同程度的DNA損傷，尤其是在修復(fù)過程中一些潛在的致癌機(jī)制及重要基因不斷出現(xiàn)。

2.1乙型肝炎病毒與DNA損傷修復(fù) 慢性乙型肝炎病毒感染顯著增加了HCC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其編碼的乙型肝炎病毒X蛋白是一種長(zhǎng)度為154個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)錄水平的反式激活病毒基因表達(dá)中具有重要作用[7]。Na等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒X蛋白通過與聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1的相互作用抑制DNA修復(fù)復(fù)合物向受損DNA位點(diǎn)的募集，從而抑制DNA損傷的修復(fù)，可能導(dǎo)致肝癌發(fā)生。Martin-Lluesma等[9]發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒X蛋白與DNA損傷結(jié)合蛋白1結(jié)合,干擾S期進(jìn)程導(dǎo)致染色體分離缺陷，形成異常的有絲分裂紡錘體和多核細(xì)胞，促進(jìn)肝癌的產(chǎn)生，解釋了乙型肝炎病毒引起的HCC染色體異常率高于其他致病因子的原因。與線粒體相關(guān)的乙型肝炎病毒X蛋白可誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，產(chǎn)生豐富的活性氧誘導(dǎo)氧化性DNA損傷并導(dǎo)致8-羥基-2-脫氧鳥苷蓄積，可能是乙型肝炎病毒X蛋白的致癌機(jī)制[10]。研究表明[11],乙型肝炎病毒X蛋白最初誘導(dǎo)DNA損傷，然后破壞核酸代謝，進(jìn)而阻止DNA修復(fù)并誘導(dǎo)HCC的發(fā)生,但其完整機(jī)制仍在探索中。

2.2丙型肝炎病毒與DNA損傷修復(fù) 丙型肝炎病毒屬于RNA病毒，現(xiàn)全球約有1.7億人感染[12]。丙型肝炎病毒感染是肝癌已廣泛證實(shí)的重要致病因素。丙型肝炎病毒可導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平升高，增加DNA損傷的發(fā)生。Machida等[12]研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒核心和非結(jié)構(gòu)蛋白3的表達(dá)激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因?qū)е录?xì)胞DNA中一氧化氮的產(chǎn)生增加和DNA雙鏈斷裂的形成，但E1蛋白的表達(dá)不通過產(chǎn)生一氧化氮而增加DNA雙鏈斷裂。隨后的研究表明丙型肝炎病毒感染導(dǎo)致線粒體膜電位降低和活性氧水平的增加，核心蛋白、E1蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白3的個(gè)體化表達(dá)能夠誘導(dǎo)活性氧進(jìn)而導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂增加[13]。Shawki等[14]的單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丙型肝炎病毒誘導(dǎo)的HCC和肝硬化患者外周血淋巴細(xì)胞的DNA損傷程度較高，出現(xiàn)DNA損傷的患者患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是無DNA損傷者的3.6倍。Pham等[15]研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒下調(diào)泛素結(jié)合酶E2S的表達(dá)阻止非結(jié)構(gòu)蛋白5A的蛋白酶體降解，使宿主細(xì)胞對(duì)DNA損傷更加敏感，該途徑可能是丙型肝炎病毒誘導(dǎo)的肝臟發(fā)病機(jī)制。Higgs等[16]發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒感染后Gadd45beta表達(dá)下調(diào)，Gadd45beta啟動(dòng)子的高甲基化是造成這種缺陷的原因。其下調(diào)導(dǎo)致異常的細(xì)胞周期停滯并減少DNA切除修復(fù)。在肝臟中丙型肝炎病毒感染和復(fù)制并不均勻并且存在個(gè)體肝細(xì)胞差異,Wang等[17]發(fā)現(xiàn)低丙型肝炎病毒載量的谷胱甘肽過氧化物酶2、減數(shù)分裂重組蛋白11、磷酸化ATM和8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶發(fā)生表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，高載量者反而下調(diào)，而在輻射下低載量者中表現(xiàn)出更強(qiáng)的存活能力。這一反常結(jié)果的原因可能是細(xì)胞內(nèi)病毒載量驅(qū)動(dòng)細(xì)胞DNA損傷水平但抑制了與損傷相關(guān)的基因表達(dá)，尚不排除來自高載量細(xì)胞的活性氧的影響。這些發(fā)現(xiàn)為丙型肝炎病毒感染細(xì)胞中不同病毒載量引起的不同DNA損傷和修復(fù)反應(yīng)提供了新的見解，并有待深入探索。

2.3黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)與DNA損傷修復(fù) 飲食中AFB1暴露是肝癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，Weng等[18]發(fā)現(xiàn)超過60%的AFB1相關(guān)的HCC攜帶p53密碼子249突變，在AFB1的兩種反應(yīng)途徑中，脂質(zhì)過氧化途徑占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，并對(duì)核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)和錯(cuò)配修復(fù)產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞突變敏感性增加。Yao等[19]在一項(xiàng)納入1 486例HCC患者和1 996名對(duì)照者的對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，AFB1暴露組和修復(fù)基因突變組HCC風(fēng)險(xiǎn)均增加，并且通過交互分析得出兩者可能存在相互作用。微囊藻毒素-LR(L:亮氨酸，R:精氨酸)與AFB1常共存于溫濕地區(qū)的污染食物和水中，同為致癌毒素。Liu等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)暴露于微囊藻毒素-LR與AFB1的人肝細(xì)胞系HL7702發(fā)生了堿基切除修復(fù)基因脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1的表達(dá)上調(diào)，與單獨(dú)暴露于等量的AFB1或微囊藻毒素-LR相比，表現(xiàn)出顯著增加的DNA損傷。此外在無AFB1暴露的情況下，微囊藻毒素-LR可顯著下調(diào)堿基切除修復(fù)基因8-氧鳥嘌呤糖基化酶1的表達(dá)從而抑制損傷修復(fù)，但其具體機(jī)制及修復(fù)蛋白活性的變化情況有待進(jìn)一步闡明。

2.4膽汁酸與DNA損傷修復(fù) 膽汁酸主要由肝細(xì)胞合成分泌，是肝臟微環(huán)境的組成部分，影響著細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)和細(xì)胞增殖[21]。甘氨鵝脫氧膽酸鈉(glycochenodeoxycholate，GCDA)是膽汁酸中的重要代謝成分，具有毒性和疏水性。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，在多種腫瘤中高表達(dá)。Zhou等[22]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中GCDA作用于環(huán)狀結(jié)構(gòu)的Ser70位點(diǎn)使Bcl-2磷酸化，激活其抗凋亡作用，是GCDA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制。Mcl-1是Bcl-2家族中的重要抗凋亡成員，在約50%的HCC患者中過表達(dá)，提示Mcl-1是一種潛在的治療靶點(diǎn)[23]。Liao等[23]發(fā)現(xiàn)GCDA于T163位點(diǎn)磷酸化Mcl-1，使其與泛素連接酶解離，增強(qiáng)了Mcl-1的抗凋亡功能，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞長(zhǎng)期存活或耐藥。Yu等[24]提出GCDA抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶并促進(jìn)Mcl-1在細(xì)胞核中積累阻礙堿基切除修復(fù)過程，亦證明MCL-1是GCDA誘導(dǎo)HCC過程中的重要因子。

2.5NAFLD與DNA損傷修復(fù) NAFLD是發(fā)達(dá)國(guó)家慢性肝病的最常見原因，波及其1/3人口總數(shù)。非酒精性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是NAFLD疾病譜的重要組成疾病，以肝細(xì)胞損傷和炎癥為特征，且可能發(fā)展為HCC[25]。近年來提出的機(jī)制為“多重打擊”假說，這些打擊包括胰島素抵抗，來源于腸道微生物群和脂肪組織的脂肪細(xì)胞因子等[26]。Gentric等[27]發(fā)現(xiàn)NASH患者肝臟中多倍體單核細(xì)胞數(shù)量增加，并伴有氧化應(yīng)激介導(dǎo)的G2/M期DNA損傷檢查點(diǎn)的激活和緩慢的S/G2細(xì)胞周期進(jìn)展。NAFLD小鼠模型中抗氧化劑治療阻止了多倍體的發(fā)展，支持了調(diào)控活性氧水平可以預(yù)防疾病進(jìn)展的觀點(diǎn)。在酒精性肝損傷的活性氧中，細(xì)胞色素P450 2E1的誘導(dǎo)起主要作用[28]，這也可能是NAFLD中活性氧導(dǎo)致?lián)p傷的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，NASH患者肝臟中細(xì)胞色素P450 2E1的表達(dá)增加，表明細(xì)胞色素P450 2E1與NAFLD患者肝臟中活性氧的產(chǎn)生有關(guān)，但具體機(jī)制尚未明確[29]。Seki等[30]發(fā)現(xiàn)NAFLD患者的脂質(zhì)過氧化標(biāo)記8-羥脫氧鳥苷的水平增加，而少見于正常肝臟。Tanaka等[31]發(fā)現(xiàn)，與無HCC的NASH相比，由NASH進(jìn)展的HCC中8-羥脫氧鳥苷陽性肝細(xì)胞的比例顯著增加?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明氧化性DNA損傷隨著NASH進(jìn)展而增加。值得注意的是，F(xiàn)ujita等[32]報(bào)道在鐵還原療法后，NASH患者肝臟中8-羥脫氧鳥苷水平顯著降低。因此，鐵過載可能是NASH患者氧化性DNA損傷的重要原因。

3 HCC的治療與DNA損傷修復(fù)

化學(xué)藥物治療幾乎是大多數(shù)無手術(shù)必要的晚期HCC患者的唯一選擇，并且HCC對(duì)大多數(shù)化療方案表現(xiàn)不同程度的耐藥性，導(dǎo)致可用于HCC的化療藥物較少。因此，迫切需要對(duì)HCC化療耐藥進(jìn)行深入研究并開發(fā)新的化療策略。許多常規(guī)的化療藥物通過誘導(dǎo)HCC細(xì)胞DNA雙鏈斷裂而發(fā)揮作用，HCC細(xì)胞通過強(qiáng)化其非同源末端鏈接活性來抵消由化療藥物造成的DNA損傷，常導(dǎo)致其化療耐藥。Yang和Wang[33]研究發(fā)現(xiàn)HCC患者的X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因4組改變率低，但在經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)治療后X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因4表達(dá)增加。臨床上，X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因4的高水平表達(dá)與晚期HCC較低的總體存活率顯著相關(guān)，表明敲除X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因4的體外和異種移植腫瘤模型對(duì)化學(xué)治療敏感，X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因4促進(jìn)癌細(xì)胞非同源末端鏈接活性，因此抑制X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因4表達(dá)的靶向藥物可以通過抑制DNA修復(fù)水平增強(qiáng)化學(xué)藥物的敏感性，可成為常規(guī)化療的有效輔助用藥。DNA依賴蛋白激酶催化亞基是非同源末端鏈接的核心組件，抑制DNA依賴蛋白激酶催化亞基活性使HCC細(xì)胞對(duì)DNA雙鏈斷裂修復(fù)減弱。肝癌的各種組織學(xué)分型中，HCC的DNA依賴蛋白激酶催化亞基表達(dá)的陽性比率最高[34]。DNA依賴蛋白激酶催化亞基不僅可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受來自微環(huán)境或化學(xué)治療藥物治療的有害DNA損傷，而且還具有獨(dú)立于其DNA修復(fù)活性的額外特性，是治療HCC的潛在靶點(diǎn)[35]。Chen等[36]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素誘導(dǎo)長(zhǎng)鏈非編碼RNA Rad51-AS1的表達(dá)，降低HCC細(xì)胞的DNA修復(fù)能力，動(dòng)物模型中進(jìn)一步證實(shí)，與單一療法相比，依托泊苷聯(lián)合褪黑素抑制腫瘤生長(zhǎng)效果增強(qiáng)。褪黑激素除抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力外，還抑制其DNA修復(fù)能力，從而增強(qiáng)放化療的細(xì)胞毒性，是潛在的輔助治療。微RNA(microRNA,miRNA/miR)的表達(dá)在腫瘤抑制中起作用，Luo等[37]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR-146a-5p通過激活DNA修復(fù)途徑和下調(diào)復(fù)制蛋白A基因，有助于抑制細(xì)胞增殖和增強(qiáng)放射敏感性，使HCC發(fā)生凋亡，miR-142-5p的進(jìn)一步大規(guī)模研究有助于為HCC尋找新的有效治療途徑。Al-Hrout等[38]對(duì)藏紅花醛在HCC中的治療機(jī)制進(jìn)行深入探索， 在體外實(shí)驗(yàn)和生物模擬實(shí)驗(yàn)中，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激，誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂并抑制DNA修復(fù)，使HCC細(xì)胞發(fā)生凋亡，這是首次關(guān)于藏紅花醛在DNA損傷修復(fù)途徑中作用的研究報(bào)道。帕布昔利布是一種口服細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6抑制劑，可有效治療乳腺癌。Huang等[39]評(píng)估了帕布昔利布聯(lián)合放療治療人類HCC的效果，ATM激酶是放療誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂的關(guān)鍵上游激酶，帕布昔利布通過蛋白磷酸酶5介導(dǎo)對(duì)ATM的抑制作用。體外和體內(nèi)研究均顯示，該過程是帕布昔利布和放療協(xié)同產(chǎn)生的，提供了一種新的聯(lián)合治療HCC策略，但其臨床試驗(yàn)尚未開展。伊立替康在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出的劑量依賴性毒性限制了其在HCC治療中的應(yīng)用。Shao等[40]發(fā)現(xiàn)在HCC細(xì)胞系中吉非替尼與伊立替康的活性代謝物SN-38聯(lián)合顯示出協(xié)同活性，并且吉非替尼加SN-38誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增強(qiáng)是胱天蛋白酶途徑激活的結(jié)果。從機(jī)制上分析，吉非替尼顯著促進(jìn)Radbi蛋白的泛素-蛋白酶體依賴性降解，抑制DNA修復(fù)，引起更多DNA損傷，并最終導(dǎo)致這兩種藥物的協(xié)同作用。此外，在HepG2異種移植小鼠模型中進(jìn)一步驗(yàn)證了吉非替尼聯(lián)合伊立替康增加的抗腫瘤功效。這表明重組酶Rad51是一種有前景的靶標(biāo)，并為研究拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑和吉非替尼聯(lián)合治療HCC的臨床試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。

4 小 結(jié)

乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、AFB1、NAFLD都可能導(dǎo)致DNA損傷，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間積累后可能導(dǎo)致HCC的發(fā)生，各種致病因素對(duì)應(yīng)著潛在的DNA損傷機(jī)制并可能存在不同層次的相互作用。DNA損傷修復(fù)不僅是HCC發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，也是化療及其他治療方式效果欠佳的重要原因。目前，醫(yī)學(xué)界對(duì)作用于DNA損傷修復(fù)的治療手段開展了許多相關(guān)研究，一些相關(guān)的基因片段已被準(zhǔn)確定位，相關(guān)的治療方案也逐漸被提出，并取得了一些效果。但肝癌中DNA損傷修復(fù)的致癌機(jī)制仍有待研究，化學(xué)藥物治療方案的改良和創(chuàng)新前景廣闊，值得深入探索。