劉果杭，谷文光，王 浩，趙子文，姜 博

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨三科，哈爾濱 150001)

骨肉瘤也稱為成骨肉瘤，是由間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的遺傳和表觀遺傳分化引起的一種分化疾病，是兒童及20歲以下青少年人群中最常見的惡性骨腫瘤。由于骨肉瘤經(jīng)軟骨階段直接或間接形成腫瘤骨樣組織和骨組織，其生長迅速，具有很高的組織破壞性和轉(zhuǎn)移率。常用的治療策略包括術(shù)前化療或放療、手術(shù)切除所有已知的病灶或轉(zhuǎn)移性組織、術(shù)后處理，但預(yù)后仍不理想。尋找新的有效預(yù)防和控制措施來提高患者的生存率和生活質(zhì)量，預(yù)防或延緩骨肉瘤的轉(zhuǎn)移十分重要，因此，針對腫瘤形成及惡化過程中的特異性靶點進(jìn)行基因治療成為目前腫瘤治療的新目標(biāo)。

微RNA(microRNA，miRNA)是一類小的內(nèi)生性的非編碼單鏈RNA分子，長度為18～25個核苷酸，miRNA通過與目標(biāo)mRNA的3′或5′端非編碼區(qū)以堿基配對的方式結(jié)合，可以降解mRNA或阻滯翻譯過程，導(dǎo)致相應(yīng)基因的表達(dá)沉默，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的多種病理生理活動，包括細(xì)胞周期的調(diào)控，細(xì)胞的生長與分化、凋亡以及胚胎發(fā)育等。另外，在人類已知的miRNA中，約有50%位于與腫瘤密切相關(guān)的染色體區(qū)域，表明miRNA在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以通過直接或間接地與靶蛋白結(jié)合從而發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，如miR-30c可通過靶向SNAI114抑制食管鱗癌的進(jìn)展[2]；miR-106b-5p可通過調(diào)控BTG315促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長并抑制細(xì)胞凋亡[3]；miR-409-3p已被報道可以通過阻斷Fip200自噬來增強卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[4]；miR-Let-7a可以通過趨化因子受體7/促分裂原活化的蛋白激酶通路誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)前列腺癌PC-3細(xì)胞侵襲遷移等[5]?，F(xiàn)對骨肉瘤相關(guān)的miRNA及其對骨肉瘤的調(diào)控通路及靶向治療等進(jìn)行綜述。

1 抑癌分子miR-34a

miR-34a是腫瘤抑制基因p53的直接靶向miRNA，通過調(diào)控p53進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡及其他生理活動。miR-34a在結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌等腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且過表達(dá)miR-34a可以抑制多種腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Avilion等[6]的研究表明miR-34a可以通過靶向調(diào)節(jié)性別決定區(qū)Y盒2翻譯水平誘導(dǎo)多能干細(xì)胞并且利于干細(xì)胞的干性維持，Wang等[7]發(fā)現(xiàn)miR-34a可以作用于腫瘤干細(xì)胞的分化、維持及轉(zhuǎn)移。

目前，有關(guān)miR-34a在骨肉瘤中的作用機制研究成為骨肉瘤治療的新方向，旨在發(fā)現(xiàn)治療的潛在靶標(biāo)及診斷的生物標(biāo)志物。唐靜等[8]通過轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物等方法證實miR-34a可以通過調(diào)控SOX2(sex determining region Y-box2)蛋白水平，調(diào)節(jié)骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力、成瘤性和遷移能力。Ponchon和Dardel[9]通過人骨肉瘤組織標(biāo)本分析證實骨肉瘤組織中的miR-34a水平顯著下調(diào)，F(xiàn)ire等[10]的研究通過在骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)強化表達(dá)miR-34a，發(fā)現(xiàn)其可以抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并抑制腫瘤的發(fā)生。王桂勇和方松青[11]的研究顯示miR-34a的模擬物及抑制劑可分別抑制和促進(jìn)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長增殖活性，提示miR-34a可能在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中起抑癌基因的作用。有研究顯示miR-34a可通過靶向眾多癌基因或促癌因素發(fā)揮作用，如趙勇[12]的研究發(fā)現(xiàn)成熟的miRNA通過RNA干擾作用來抑制SIRT1、BCL2、CDK6與cMET基因的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)蛋白水平上的翻譯，接著引起細(xì)胞周期捕獲、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞侵襲能力下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞及動物體內(nèi)水平的細(xì)胞生長抑制。

肺部是骨肉瘤轉(zhuǎn)移最常見的部位，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率僅為25%～30%，骨肉瘤的轉(zhuǎn)移已成為目前治療骨肉瘤的一大難題。Steeg[13]研究表明癌癥侵襲-轉(zhuǎn)移過程是由多種信號通路及信號通路間的互補代償機制驅(qū)動的，因此在治療致死性腫瘤轉(zhuǎn)移時通過針對某個特定的靶向分子或信號通路往往無效。目前，多通路或多靶向的聯(lián)合治療已被證明是對抗腫瘤轉(zhuǎn)移的有效手段。簡超[14]研究證實，生物工程合成的轉(zhuǎn)運RNA/miR-34a嵌合體作為前體藥在細(xì)胞內(nèi)以miR-34a的形式可以有效抑制骨肉瘤生長，該實驗使用合理設(shè)計的阿霉素、轉(zhuǎn)運RNA/miR-34a前體藥和索拉非尼三聯(lián)藥物治療，共靶向關(guān)鍵DNA、信使RNA和蛋白質(zhì)分子以形成“飽和攻擊”原位腫瘤及其轉(zhuǎn)移，明顯抑制了骨肉瘤原位生長以及自發(fā)的肺轉(zhuǎn)移，延緩了骨肉瘤的進(jìn)展，即使疾病晚期肺部已出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移灶仍可延長生存期，最終改善預(yù)后。趙勇[12]的研究表明，基因工程獲得的miR-34a前體藥物不會帶來明顯的全身毒性作用，其作用機制可能為miR-34a相對特異地誘導(dǎo)了骨肉瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期捕獲。

2 抑癌基因miR-570-3p

自噬在腫瘤中的功能十分復(fù)雜，正常生理狀態(tài)下的自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)原發(fā)的引起DNA損傷的物質(zhì)，如活性氧類、受損傷的線粒體和錯誤折疊的蛋白質(zhì)等，從而維持基因組DNA的完整性和穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生。雖然基礎(chǔ)水平的自噬對細(xì)胞是一種保護性作用，但是過度自噬也會引起自噬性細(xì)胞死亡甚至加速疾病的進(jìn)展。自噬性細(xì)胞死亡是一種程序性細(xì)胞死亡，已成為不同類型腫瘤遷移和侵襲能力的重要標(biāo)志[15]。在一些轉(zhuǎn)移性腫瘤中，治療前高水平的自噬通常預(yù)示著侵襲性較強，對化療的敏感性較低，生存期及預(yù)后較差[16]。

二甲雙胍是一種安全高效的雙胍類降糖藥，作為胰島素增敏劑，二甲雙胍能夠通過減少肝糖原異生，增加周圍組織對胰島素的敏感性，抑制腸道細(xì)胞吸收葡萄糖發(fā)揮降糖作用，有效降低血液胰島素水平。流行病學(xué)研究表明二甲雙胍可以減輕多種腫瘤的進(jìn)展，二甲雙胍可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬抑制腫瘤細(xì)胞的生長[17]。二甲雙胍的抗腫瘤作用機制尚未明確，但二甲雙胍是能量調(diào)控信號分子腺苷酸活化蛋白激酶的激動劑，激活腺苷酸活化蛋白激酶負(fù)向調(diào)控下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路可能是其抗腫瘤作用的機制之一。但腺苷酸活化蛋白激酶在腫瘤中是癌基因還是抑癌基因尚存在爭議，其受上游肝激酶B1/絲蘇氨酸激酶11的調(diào)控，肝激酶B1/絲蘇氨酸激酶11的表達(dá)缺失或基因突變所致功能缺失都會影響二甲雙胍對腺苷酸活化蛋白激酶的激活。

Zhong等[18]和Yan等[19]的研究證實二甲雙胍可以引起DNA去甲基化，并導(dǎo)致部分編碼基因和非編碼RNA的上調(diào)。Bao等[20]的研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以削弱骨肉瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的遷移和侵襲能力，減輕骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和過度自噬，其機制可能是二甲雙胍通過對DNA的脫甲基化來增加miR-570-3p的表達(dá)，這種上調(diào)抑制了靶蛋白的翻譯，即肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因12——肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演重要角色,而細(xì)胞凋亡相關(guān)基因12在許多腫瘤中是一個相當(dāng)重要的自噬標(biāo)記。這也表明，可以通過上調(diào)miR-570-3p，抑制肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因12的翻譯，促進(jìn)二甲雙胍對骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用。

目前，關(guān)于二甲雙胍對人骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響以及轉(zhuǎn)移與自噬的相互作用的資料還較少，針對這一方向還需進(jìn)一步研究，以發(fā)現(xiàn)腫瘤治療的新靶點。

3 抑癌基因miR-222

miR-222是屬于miR-221/miR-222的miRNA簇，miR-221、miR-222編碼位于人X染色體，高度保守，只有相同的種子序列，在多數(shù)腫瘤中表達(dá)失調(diào)。有文獻(xiàn)報道m(xù)iR-222在乳腺癌、甲狀腺癌、腦膠質(zhì)瘤和肝癌等腫瘤中都具有顯著的調(diào)控作用，說明miR-222在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用：Wong等[21]的研究結(jié)果表明在肝細(xì)胞癌中，miR-222的過表達(dá)能夠通過激活蛋白激酶B通路促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Liu等[22]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中,miR-221/miR-222調(diào)節(jié)反饋循環(huán)保持了核因子κB和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3的基本活性。Galardi等[23]證實，在人前列腺癌細(xì)胞系中，miR-221/miR-222可以通過靶向p27Kip1影響細(xì)胞生長潛能。然而，關(guān)于miR-222在骨肉瘤中的功能尚不清楚。

Chu等[24]研究了miR-222在骨肉瘤中的作用機制及功能。實驗結(jié)果顯示與正常組相比，骨肉瘤組織及骨肉瘤細(xì)胞系中miR-222的表達(dá)明顯降低，另外，過表達(dá)的miR-222降低了人骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖及侵襲，而敲除miR-222基因可以促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞的生長和代謝。該實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)YWHAG是miR-222的一個潛在靶點，過表達(dá)的miR-222可以抑制YWHAG的表達(dá)，反之減少miR-222的表達(dá)可以提高YWHAG的表達(dá)，此外，上調(diào)YWHAG的表達(dá)可以修復(fù)miR-222模擬物的抑制作用。YWHAG是14-3-3蛋白家族的一員，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌和血液學(xué)腫瘤[25-27]等腫瘤中被報道為腫瘤啟動子，它可以促進(jìn)不同癌癥的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，其致癌功能可通過多種miRNA調(diào)控，如在乳腺癌中，miR-181b-3p可通過直接靶向YWHAG促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，miR-217可以通過調(diào)節(jié)YWHAG促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力[25,28]。在骨肉瘤中，YWHAG已被報道可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移，并在骨肉瘤調(diào)節(jié)進(jìn)程中作為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2抑制和前凋亡蛋白上調(diào)之間的鏈接蛋白發(fā)揮作用[29]。這一系列研究結(jié)果證明了miR-222可通過下調(diào)YWHAG抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力。

上述結(jié)果提示miR-222可以抑制骨肉瘤進(jìn)展，強調(diào)了miR-222作為骨肉瘤抑制因子的結(jié)果[20]，這可能是骨肉瘤治療的一個潛在的生物學(xué)靶點。

4 其他相關(guān)miRNA

盡管國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多個miRNA與骨肉瘤相關(guān)，但是已證實的有明確靶基因及明確功能的miRNA并不多，除上述介紹的幾種miRNA外，還有如下幾種miRNA：吳子晏等[30]的研究發(fā)現(xiàn)miR-21在骨肉瘤組織中明顯過表達(dá)，miR-21可以通過降低RECK基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Liu等[31]的研究發(fā)現(xiàn)miR-125b能夠通過下調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3，miR-199a-3p能夠通過下調(diào)哺乳動物雷帕霉素和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3的表達(dá)，抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移。Hirahata等[32]認(rèn)為，miR-143可以通過其低表達(dá)導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶-13的上調(diào)，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Zhang等[33]發(fā)現(xiàn)miR-195能夠作用于FASN基因抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。此外miR-92b可通過靶向RECK促進(jìn)骨肉瘤增殖、侵襲和遷移；miR-199a-5p可雙重靶向活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3抑制物和p27，促進(jìn)人骨肉瘤腫瘤生長；miR-135b和含有盤狀同源區(qū)域結(jié)合模序的轉(zhuǎn)錄共激活物可以形成促進(jìn)骨肉瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生的反饋環(huán)；miR-491作為一個腫瘤抑制因子通過抑制αB-crystallin7-10進(jìn)而抑制骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移和骨肉瘤的藥物耐藥性[34-37]。

5 治 療

骨肉瘤中差異性表達(dá)的miRNA無疑為骨肉瘤的治療提供了新的治療靶點。目前基于骨肉瘤中異常表達(dá)的miRNA的治療手段主要包括如下幾個方面：①利用反義寡核苷酸抑制癌基因miRNA的表達(dá)；②使用miRNA模擬物促進(jìn)抑癌基因miRNA的表達(dá)；③使用鎖定核酸技術(shù)來提高miRNA與靶基因的親和力；④表達(dá)載體miRNA海綿，可以有效降低細(xì)胞中miRNA的含量。然而miRNA在實驗室研究中仍存在一些問題，主要集中在以下幾個方面：①miRNA制備過程中數(shù)量和質(zhì)量的不穩(wěn)定性；②辨別miRNA靶點和驗證miRNA生物功能的復(fù)雜性等。而將miRNA治療技術(shù)從實驗室應(yīng)用到臨床工作所需的必要條件仍需探討，例如如何選擇miRNA的傳遞載體，如何控制miRNA調(diào)節(jié)藥物的特異性及失靶作用，如何減少miRNA介導(dǎo)藥物或化合物的體內(nèi)毒性，以及如何通過量-效關(guān)系試驗確定miRNA調(diào)節(jié)藥物的最低有效劑量，如何通過制劑的修飾和改進(jìn)降低有效劑量等。只有解決上述問題，才能使針對miRNA的靶向治療真正應(yīng)用到臨床，從而延長骨肉瘤患者的生存期及生活質(zhì)量。

6 小 結(jié)

近年來，越來越多的實驗研究證明骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展與miRNA對基因的調(diào)控作用密切相關(guān)。更重要的是，腫瘤相關(guān)miRNA生物標(biāo)志物可以在生物體液中被檢測到，這也使miRNA成為骨肉瘤的潛在生物標(biāo)志物和藥物治療靶點。腫瘤miRNA分析可以協(xié)助確定腫瘤相關(guān)亞型、評估患者生存率和對治療的反應(yīng)，是癌癥診斷和預(yù)后評估的重要組成部分。所以，研究miRNA在骨腫瘤，尤其是最常見的骨肉瘤中所起到的作用有一定臨床意義。

盡管miRNA與骨肉瘤的研究仍處于起步階段，許多miRNA的功能和作用途徑仍不明確，但越來越多的miRNA干預(yù)的成功應(yīng)用已在基礎(chǔ)研究中被證實，少部分miRNA已在嘗試進(jìn)行臨床藥物試驗。快速發(fā)展的miRNA作為一類新興藥物作用靶點，將更廣泛地應(yīng)用于骨科腫瘤的治療領(lǐng)域。同時，miRNA與靶基因之間的作用通路，miRNA之間的相互調(diào)控，以及miRNA在骨肉瘤增殖、分化、轉(zhuǎn)移等方面的功能還需要進(jìn)一步研究。