陳欣林，施明杰，林澤桁，張玉明，石 明※

(1.廣東醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，東莞市環(huán)境醫(yī)學重點實驗室，廣東 東莞 523808； 2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院小兒科，廣州 510515)

超抗原是在極低濃度下可非特異地刺激多數(shù)T細胞克隆活化增殖，產生極強免疫應答的一種蛋白分子，主要由細菌外毒素或逆轉錄病毒產物組成[1]。超抗原可分為外源性超抗原[如金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcalenterotoxins，SEs)、鏈球菌致熱外毒素、M蛋白等]和內源性超抗原(如小鼠乳腺瘤病毒)。金黃色葡萄球菌腸毒素C(Staphylococcalenterotoxins C，SEC)是由金黃色葡萄球菌產生的外源性超抗原，具有強大的T細胞活化能力。金黃色葡萄球菌是一種多功能病原體，可產生一系列對人類和動物具有毒理作用的外蛋白，如透明質酸酶、葡萄球菌激酶、核酸酶、脂肪酶、蛋白酶、膠原酶、溶血素、剝脫性毒素和含有毒性的超抗原蛋白。其中，超抗原蛋白包括中毒性休克綜合征毒素1、葡萄球菌腸毒素樣蛋白和SEs。SEC是SEs的一種血清型，能高效活化大量T細胞，并產生多種細胞因子，參與免疫應答?，F(xiàn)就SEC的生物學活性及其在抗腫瘤和骨科相關疾病的臨床應用及SEC突變體蛋白的研究進展予以綜述。

1 SEC的概述

若新發(fā)現(xiàn)SEs與先前已知SEs具有≥90%的同源性，則會被指定為先前SEs的亞型[2-3]。SEC是經典腸毒素之一，分子量為27 000～27 600，有SEC1、SEC2、SEC3三種亞型[4]。此外，SEs亞型的其他名稱可以指代“變體”而不是指定的數(shù)字，如從由綿羊、山羊或牛來源的乳腺炎病例分離的金黃色葡萄球菌菌株產生的SEC變體的情況，命名為綿羊SEC、山羊SEC和牛SEC，顯示出獨特的宿主特異性[5]。

SEC1、SEC2和SEC3是6種SEC亞型中的成熟毒素，具有高度同源性，同時也是SEC研究的焦點。SEC2和SEC3僅相差4個氨基酸，同源性為98.3%；SEC1和SEC2相差9個氨基酸，同源性為97.1%；而SEC1與SEC3亦相差9個氨基酸，同源性為96.2%[6-7]。不同毒素的刺激活化能力不同，但所有SEC亞型都會引起淋巴細胞增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，SEC3在口服和靜脈注射的猴子模型中均具有高度催吐毒性，故SEC1和SEC2在免疫治療方面的應用相對較多[8]。

SEC具有強大的超抗原活性，中國早已生產出金葡素注射液，并應用于臨床，其主要成分是SEC、蛋白質、多肽、18種氨基酸和游離凝固酶。超抗原依賴性細胞介導的細胞毒性是SEC發(fā)揮抗腫瘤作用的主要機制[9]。此外，活化的T細胞可分泌多種細胞因子，包括白細胞介素-2、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、γ干擾素等，進一步激活自然殺傷細胞轉化為淋巴因子激活的殺傷細胞，釋放蛋白和溶細胞素，誘導細胞死亡，從而殺死對自然殺傷細胞不敏感的腫瘤細胞，抑制腫瘤生長[10-11]。另有研究表明，超抗原刺激淋巴細胞可導致T細胞依賴性B細胞的分化[12-13]。SEC2通過Toll樣受體-核因子κB信號通路刺激骨髓來源的樹突狀細胞的成熟，從而影響抗原呈遞細胞，增強免疫效應[14]。此外，超抗原SEC還可通過刺激主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)類分子非依賴性途徑引起T細胞擴增，從而加強免疫殺傷作用[15]。

在經典作用模式中，超抗原活化T細胞不需要抗原呈遞細胞的加工處理，以完整的蛋白質形式呈遞給T細胞，一端在抗原肽結合槽外，直接與抗原呈遞細胞膜上的MHCⅡ類分子的α/β鏈的非多態(tài)區(qū)外側結合；另一端直接與T細胞受體復合物(T-cell receptor complex，TCR)的Vβ鏈的C區(qū)結合，形成MHCⅡ-超抗原-TCR三元復合物。T細胞的活化過程具有MHCⅡ分子依賴性，SEC與抗原呈遞細胞上的MHCⅡ分子上α/β鏈的非多態(tài)區(qū)外側的特殊位點架橋連接，分別位于α鏈的低親和力結合位點和β鏈的鋅配位高親和力結合位點[16-17]。研究表明，MHCⅡ分子在β1結構域、α1結構域和α2結構域上具有主要結合位點[18]。

SEC還可以通過MHC分子非依賴性T細胞激活途徑，使T細胞擴增和產生細胞毒性T淋巴細胞[19]。對MHCⅡ分子缺陷人類細胞的研究發(fā)現(xiàn)，超級抗原SEC1支持純化的人T細胞增殖；SEC2在缺陷細胞存在下抑制SEC1介導的T細胞活化，表明SEC2可與SEC1競爭結合TCR。SEC1的N端附近的特定氨基酸(如L20T和E22G)在促進Ⅱ類非依賴性TCR相互作用中起關鍵作用，即使MHCⅡ陽性抗原呈遞細胞存在時，也不影響活化T細胞的效果。TCR結合親和力或SEC1-TCR相互作用的拓撲結構的細微差異可以補償MHCⅡ類分子的缺乏，并促進T細胞增殖[15]。

2 SEC的臨床應用

2.1SEC抗腫瘤的臨床應用 SEC的臨床應用經驗主要來自中國衛(wèi)生部批準的國家一類生物制品金葡素注射液。金葡素注射液主要用于癌癥和骨科疾病的臨床治療。SEC可以優(yōu)先對MHCⅡ陽性的腫瘤細胞產生強烈的T細胞介導的細胞毒性，從而抑制腫瘤生長[20]。金葡素注射液常用于治療惡性胸腔積液和腹水[21-22]。惡性胸腔積液是多種惡性腫瘤(如乳腺癌，肺癌、非小細胞癌等)中晚期常見的并發(fā)癥，病死率較高，患者出現(xiàn)循環(huán)障礙和呼吸困難的可能性增加，嚴重者危及生命。金葡素注射液常聯(lián)合順鉑、奈達鉑等藥物治療惡性胸腔積液，患者可耐受、毒副作用小，治療效果較好。金葡素注射液還可增加因放療、化療而減少的白細胞，提高患者生存質量和化療的耐受性[23-24]。此外，金葡素注射液也可用于直接治療腫瘤，如微波凝固治療后，在超聲引導下將金葡素注射液注射到肝內肝癌組織中。腫瘤部位的免疫組織化學染色顯示，金葡素注射液治療可顯著增加抗腫瘤相關免疫細胞的數(shù)量，并改善局部免疫反應[25]。金葡素注射液還可用于治療氣胸[26]，乳糜胸[27]，胸瘺[28]，腹瘺和皮下積液等疾病[29]。金葡素注射液抗腫瘤效果顯著，出現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉等毒性作用輕微，尚未見嚴重不良反應發(fā)生。

2.2SEC骨科治療的臨床應用 金葡素注射液也用于骨科疾病的治療。金葡素注射液可全身應用，并可局部注射于骨折斷端或骨不連接處，促進骨折愈合[30]。金葡素注射液用于骨缺損、骨壞死等疾病時，也表現(xiàn)出良好的效果[26-27]。以纖維蛋白膠為載體修復骨缺損模型的細胞水平研究發(fā)現(xiàn)，金葡素注射液可修復骨缺損，避免金葡素注射液的局部注射缺陷，提高藥物療效[31]。金葡素注射液主要通過改善骨折斷端局部血供、促進成骨細胞分化成熟等途徑加快骨代謝，促進斷骨愈合。可見，金葡素注射液的骨科應用具有巨大潛力，但其機制還需進一步研究探索。

3 SEC突變體蛋白的研究進展

金葡素注射液已在中國用于癌癥臨床治療20余年，SEC2是金葡素注射液的主要作用成分。金葡素注射液中SEC2的高分子量導致其通過生物屏障的滲透性差，且存在一定的毒副作用(如發(fā)熱、局部紅腫和胃腸道反應等)，限制了其廣泛應用。此外，金葡素注射液的復雜成分也是重要的限制因素，主要效應物質SEC2在注射產品中的濃度非常低，占注射產品總蛋白質的比例<0.1%，故應對注射制劑進行優(yōu)化改良[32]。近年來，為增強其超抗原特性，減少毒副作用，擴大SEC2的臨床應用范圍，已陸續(xù)出現(xiàn)了許多SEC2蛋白突變體。

SEC突變體研究早期，Wang等[33]通過刪除SEC2分子中N端或C端的氨基酸殘基(不影響超抗原活性)的方法，構建用于免疫療法的低分子量超抗原劑(即一系列SEC2突變體)，以探求SEC2的生物活性結構區(qū)域，實驗表明，缺失N端11個殘基的突變體對T細胞刺激活性沒有影響，且N端的進一步缺失可嚴重抑制T細胞增殖的能力，可見，N端是T細胞增殖所必需的；而C端缺失77個氨基酸殘基的突變體保留了SEC2超抗原活性，更多C端氨基酸的去除則會降低SEC2的超抗原活性和致熱活性，該實驗大致確定了SEC2的生物活性結構區(qū)域，對相關后續(xù)研究具有指導意義。

在構建SEC2突變體蛋白過程中，通過定點突變改變蛋白分子中與毒性相關的活性部位的氨基酸組成，可降低毒性、保留或提高其超抗原活性，已成為目前SEC突變體研究的熱點，且選擇突變位點尤其重要。研究表明，丙氨酸或絲氨酸取代第93位半胱氨酸和第110位半胱氨酸的定點誘變可干擾二硫鍵的形成，所形成的突變體可誘導T細胞增殖，并降低腫瘤細胞的細胞毒性作用，由此可見，二硫環(huán)結構對維持SEC2的最大超抗原活性有重要作用[34]。第93位半胱氨酸、第110位半胱氨酸和第118位的組氨酸殘基是負責嘔吐的功能位點。若以這3個功能位點作為取代位點，則可能使新SEC2突變體的催吐活性失活，為臨床腫瘤治療提供新的SEC2突變體免疫治療劑[35]。SEC2晶體結構有2個鋅結合位點，由位于第47位、第118位和第122位的組氨酸殘基介導位點形成，鋅結合可能對SEC2的生物活性起作用[36-37]。另有研究發(fā)現(xiàn)，SEC2中的第47位的組氨酸殘基參與MHCⅡ分子結合，對抗原活性起重要作用，但對毒性作用影響甚小，突變體取代第47位的組氨酸殘基可對T細胞的增殖能力造成損害[38-39]。同時，鋅配位的第118位氨酸殘基和第122組氨酸殘基與抗原活性無關，在SEC2的催吐和發(fā)熱中起關鍵作用。由此可見，突變體可將SEC2的超抗原特性和毒性分離，既可降低毒性，也可保持或提高超抗原特性，且不會造成沖突，為SEC2突變體的開發(fā)提供了新思路[38]。

3.1SEC突變體蛋白的抗腫瘤研究進展 近年來，SEC抗腫瘤的臨床治療效果顯著，其抗腫瘤的作用成為研究的重點，現(xiàn)已出現(xiàn)的突變體蛋白，在結構和功能上均有差別。通過定點突變SEC2中第20位蘇氨酸和第22位甘氨酸而獲得的SEC2(T20L/G22E)突變體，與野生型SEC2相比，其超抗原活性和腫瘤細胞的生長抑制活性均得到增強；體內進一步的毒性實驗表明，與SEC2相比，SEC2(T20L/G22E)的催吐和熱原活性無顯著增強[40]。引入丙氨酸取代SEC2分子中第144位苯丙氨酸和第45位亮氨酸所構建的mSEC2(F44A，L45A)突變體，具有與SEC2相當?shù)拇碳ち馨图毎鲋巢⒁种颇[瘤細胞的能力，但能顯著減弱致熱毒性[41]。

Zhang等[42]運用重疊聚合酶鏈反應將天然SEC2的第102～106位(即GKVTG)氨基酸殘基換為WWH、WWT和WWP(SEC3突變體第102～104位氨基酸殘基的名稱，WWH對應SEC3 1A4、WWT對應SEC3 1D1、WWP對應SEC3 1D3)，并將3種突變體分別命名為ST-1、ST-2和ST-3。與天然SEC2相比，以上3種突變體可改善小鼠淋巴細胞增殖，抑制腫瘤細胞生長；ST-1和ST-3的發(fā)熱活性與天然SEC2相當，但ST-2的發(fā)熱活性較天然SEC2顯著增強。Zhang等[43]將SEC2的第102～106位殘基用WWH代替為WWD，命名為ST-4(GKVTG102-106WWH)。與野生型SEC2相比，ST-4可以激活更多的TCR-Vβ8.2和TCR-Vβ8.3T細胞和自然殺傷細胞，這些活化細胞增加釋放顆粒酶B和穿孔素，通過線粒體凋亡途徑誘導腫瘤細胞凋亡增強。有研究指出，SEC2/ST-4可通過磷脂酰肌醇-3-激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和核因子κB信號通路參與T細胞活化，ST-4增強磷脂酰肌醇-3-激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和核因子κB信號轉導，最終導致T細胞活化增強[44]。

與野生型SEC2(rSEC2)相比，突變體SAM-3(T20L/G22E/H118A/H122A)增加了TCR結合親和力，有助于大量T細胞活化和細胞因子的釋放[45]。SAM-3還可以激活人TCR-Vβ12、3a、14、15、17和20的CD8+T細胞，以增強免疫應答。此外，活化T細胞分泌的腫瘤壞死因子-α可誘導腫瘤細胞凋亡和G1期阻滯，對HepG2腫瘤細胞產生殺傷作用。T細胞可通過多種途徑誘導腫瘤，SAM-3可通過T細胞上調腫瘤壞死因子受體1信使RNA的表達以及胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8的活性，介導腫瘤細胞凋亡[46]。

對各種突變體的分析和比較，有利于拓寬新藥物SEC的研發(fā)思路，也可從中盡可能找出最合理優(yōu)化的突變體，進行下一步臨床試驗，加快臨床藥物的研發(fā)進程。

3.2SEC突變體蛋白的骨科研究進展 SEC雖已應用于臨床治療骨折等骨科疾病，但效果有待提高，且其作用機制仍在探索中。近年來，有學者對突變體2M-118(H118A/T20L/G22E)的骨科應用展開研究。SEC2中第118位組氨酸被丙氨酸取代，第20位蘇氨酸被亮氨酸取代，第22位甘氨酸被谷氨酰胺取代，得到2M-118突變體。在人間充質干細胞上，2M-118可通過上調骨形成蛋白2和Runt相關轉錄因子2/核心結合因子α1的表達，顯著改善成骨細胞分化，干擾素誘導的基因IFI16也可在成骨細胞分化中被2M-118激活；2M-118還可通過上調骨保護素的表達和抑制核因子κB受體活化因子配體的表達，使骨保護素/抑制核因子κB受體活化因子配體的比值升高，從而抑制人間充質干細胞中破骨細胞的生成，促進骨再生[47]。

對大鼠骨髓間充質干細胞的體外研究發(fā)現(xiàn)，與磷酸緩沖鹽溶液相比，2M-118可促進成骨分化并增強礦化，且堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白等骨標志物基因顯著上調，且對大鼠體內牽張成骨模型的研究發(fā)現(xiàn)，2M-118治療組骨體的骨體積分數(shù)明顯升高，新骨形成和鞏固明顯加快，脛骨的機械性能增加，促進牽張成骨和增強骨固結[48]。對大鼠股骨骨折模型的研究發(fā)現(xiàn)，與磷酸緩沖鹽溶液相比，局部使用2M-118可通過增加骨折愈合組織體積、上調骨體積分數(shù)和促進生物力學恢復來加速骨折愈合，與磷酸緩沖鹽溶液相比，2M-118治療組具有更好的組織學外觀[49]。綜上所述，2M-118突變體可通過抑制破骨細胞形成加快鈣沉積，從而加快成骨并增強骨固結，促進骨折愈合。2M-118突變體可成為促進骨修復的潛在治療劑，應用于臨床骨科疾病治療。但仍需要進一步的研究以了解2M-118突變體促進骨生成和骨折愈合的機制，進一步在臨床研究中驗證在人體中的作用。

前交叉韌帶損傷難以治愈，關節(jié)鏡下自體腘繩肌腱移植重建是治療前交叉韌帶損傷的主要方法，促進術后肌腱與骨隧道的良好愈合尤為重要。對兔膝關節(jié)建立前交叉韌帶重建模型的研究發(fā)現(xiàn)，局部注射SEC可啟動局部無菌性炎癥反應，加快腱骨界面血管生成、激活骨細胞和纖維細胞大量增殖，有效促進前交叉韌帶重建后移植肌腱與骨隧道的愈合，為加快前交叉韌帶術后愈合提供了新方法[50]。

3.3SEC突變蛋的其他應用及研究進展 隨著研究的進展，SEC突變體在其他方面的應用逐漸被發(fā)現(xiàn)。惡性腫瘤患者并發(fā)致命性血栓栓塞性疾病十分常見，臨床上將惡性腫瘤相關性血栓稱為Trousseau綜合征。目前尚無有效方法或適當藥物預防和治愈腫瘤血栓栓塞，為了預防和治療腫瘤，采取有效措施或尋找合適的藥物十分重要。有學者提出，可利用超抗原的抗腫瘤特性和葡激酶(staphylokinase，Sak)的血栓溶解活性將兩者結合起來，共同用于治療腫瘤血栓。Hui等[51]通過9-丙氨酸-連接器將SEC2和Sak基因連接，成功構建Sak-連接器-SEC2和SEC2-連接器-Sak，兩種嵌合蛋白都具有與SEC2幾乎相同的外周血單個核細胞增殖刺激活性、抗腫瘤活性以及與Sak樣的血栓溶解活性。但由于SEC2的固有催吐活性和嵌合蛋白的高分子量(重均分子量為44 000)，這種嵌合蛋白仍需進一步優(yōu)化。Hui等[52]構建了較Sak-連接器-SEC2和SEC2-連接器-Sak分子量更低、無催吐反應、無多聚組氨酸標簽和無連接器的截短雙功能嵌合蛋白(ΔSEC2-ΔSak和ΔSak-ΔSEC2)，與前者相比，這種截短的蛋白質保留了幾乎相同的抗腫瘤和溶栓活性，但分子量更小，重均分子量僅為29 000，其免疫反應性略低于ΔSEC2-ΔSak和ΔSak-ΔSEC2。為了增加腫瘤治療的特異性和靶向性，現(xiàn)將腫瘤靶向肽-奧曲肽與雙功能嵌合蛋白結合形成新的融合蛋白pET-28a-ΔSEC2-ΔSak和pET-28a-ΔSak-ΔSEC2，此種融合蛋白可顯著刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，明顯抑制人胃癌細胞的生長，還具有溶栓活性，表明融合蛋白可以特異性靶向腫瘤表面，對腫瘤的靶向治療及溶栓治療具有重要意義[53]。

為了增加患者依從性和減少毒副作用，雖SEC2作為靜脈內蛋白質藥物，學者們也對其口服給藥途徑展開研究。用His標記的SEC2(SEC2-His)對SEC2作為潛在口服蛋白藥物的抗腫瘤活性和毒性的研究發(fā)現(xiàn)，高劑量口服給藥不會導致顯著毒性，且SEC2-His可以免疫整合形式穿過腸上皮，維持抗腫瘤活性，但具有更低的全身毒性[54]。此外，狂犬病是人畜共患病，死亡率近100%，最新研究表明，疫苗聯(lián)合SEC2免疫的小鼠產生了更具特異性的抗狂犬病抗體，促進狂犬病疫苗誘導的特異性免疫應答，SEC2可作為狂犬病疫苗的佐劑，對預防狂犬病具有重大意義[55]。既往有關SEC2的研究都集中在T細胞激活的特征，但SEC2也可以通過Toll樣受體-核因子κB信號轉導途徑刺激小鼠骨髓來源的專業(yè)抗原呈遞細胞-樹突狀細胞成熟，以增強免疫應答[14]。

4 小 結

超抗原SEC，特別是SEC2，具有非常強大的免疫調節(jié)作用，應用領域逐漸多樣化，如抗腫瘤治療、骨科疾病、溶栓、疫苗佐劑等。SEC的研究價值日益提高，盡管還存在胃腸道反應和致熱等毒副作用，但隨著先進的分子生物學和相關技術的快速發(fā)展，許多SEC2突變體的成功構建有利于更優(yōu)質候選藥物的篩選，并通過改善SEC效果和減少不良反應，生產出更安全、高效、無毒副作用的生物制劑，擴展SEC的臨床應用范圍。