趙煒杰，趙光強(qiáng)綜述，葉聯(lián)華審校

0 引 言

肺癌是惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一，其中，非小細(xì)胞肺癌是肺癌最常見的類型，其發(fā)病率占所有肺癌的80%～85%［1］。然而，即使行肺癌全切除手術(shù)（包括腫瘤全切除加系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃）的I 期NSCLC 患者，術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的幾率仍然高達(dá)25%～30%［2-3］，提示這些患者很有可能發(fā)生了微轉(zhuǎn)移。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微轉(zhuǎn)移得以更加快速和精確地檢測(cè)并應(yīng)于臨床研究，并成為現(xiàn)代精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一［3-4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移在腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是I 期NSCLC 患者死亡的主要原因。本文從淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的概念、臨床檢測(cè)方法和檢測(cè)標(biāo)記物、以及對(duì)預(yù)后和輔助治療等方面的作用作一綜述。

1 微轉(zhuǎn)移的概念和意義

腫瘤的微轉(zhuǎn)移，又稱隱匿性轉(zhuǎn)移，一般是指原發(fā)腫瘤被根治后，仍有少量腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散并依存于淋巴管、骨髓及外周血液循環(huán)中，尚未形成顯性轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。使用常規(guī)影像學(xué)檢查方法如（CT、B 超、骨掃描等）以及病理學(xué)檢查等均難以檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的隱性微轉(zhuǎn)移［5］。由于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是大多數(shù)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)以及評(píng)估預(yù)后的重要參考指標(biāo)，因此，相較于骨髓及外周血，檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移更為重要。

淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，可參考美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）的診斷標(biāo)準(zhǔn)：在常規(guī)病理檢查陰性的淋巴結(jié)中檢測(cè)到單個(gè)腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞團(tuán)的最大直徑＜0.2mm 即發(fā)生了淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移［6］。對(duì)肺癌患者術(shù)后淋巴結(jié)標(biāo)本進(jìn)行單張石蠟切片及HE 染色是實(shí)際操作中診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移最常規(guī)的方法，這些殘留的腫瘤細(xì)胞極易被正常淋巴組織掩蓋或遺漏。因此需要運(yùn)用分子生物學(xué)及免疫組化的技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)［7］。

2 非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方法及常用標(biāo)志物

2.1 HE 染色HE 染色是目前臨床上診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移最常用的方法，具有簡(jiǎn)便、易操作等特點(diǎn)，但是這種方法由于取材部位的局限以及不同病理醫(yī)師技術(shù)水平不同的主觀因素等因素，可能會(huì)漏掉淋巴結(jié)組織中的微轉(zhuǎn)移病灶。解決的方式是對(duì)單枚淋巴結(jié)進(jìn)行連續(xù)切片來避免漏診，但有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)單枚癌的淋巴結(jié)標(biāo)本連續(xù)切片30次后，常規(guī)病理檢查仍有漏診存在。

2.2 免疫組化法（immunohistochemistry, IHC）IHC 是通過免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)，利用顯色劑對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)組織細(xì)胞的檢測(cè)。這種檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，價(jià)格相對(duì)便宜，敏感度達(dá)10-5～10-6，故目前多數(shù)學(xué)者采用IHC 法進(jìn)行肺癌微轉(zhuǎn)移的研究。采用IHC 法檢測(cè)肺癌微轉(zhuǎn)移的常用分子標(biāo)記物有細(xì)胞角蛋白家族、組織多肽性抗原、癌胚抗原和上皮特異性抗原等［7］。但由于組織特異性蛋白抗原，如細(xì)胞角蛋白廣泛分布于上皮腫瘤，因此在檢測(cè)過程中可能出現(xiàn)假陽性，同時(shí)由于缺乏規(guī)范診斷標(biāo)準(zhǔn)，需要連續(xù)切片增加可行性，增加了檢測(cè)工作的復(fù)雜性。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)RTPCR 是通過提取組織標(biāo)本中的RNA，采用其中的mRNA為模板通過反轉(zhuǎn)錄和進(jìn)行PCR擴(kuò)增來獲得目的基因，通過與腫瘤標(biāo)記物的mRNA 進(jìn)行對(duì)比來證實(shí)腫瘤細(xì)胞存在。無需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片是該方法的優(yōu)勢(shì)，敏感性高達(dá)10-6～10-7，但由于外環(huán)境中RNA 不穩(wěn)定易污染，也可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果假陽性率的升高，但RT-PCR 依舊是理論上診斷標(biāo)本微轉(zhuǎn)移最可靠方法。PCR 常用的標(biāo)記物有肺組織特異性蛋白、粘蛋白-1和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶等［8］。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）FCM是使用流式細(xì)胞儀使用單克隆抗體、激光和計(jì)算機(jī)掃描等技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本懸液中的細(xì)胞，記錄抗原抗體結(jié)合時(shí)發(fā)出的熒光，可以短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行分類收集的技術(shù)。FCM 具有快速，準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)，并可以實(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。FCM 由于價(jià)格昂貴且存在一定的假陽性限制了其應(yīng)用。

2.5 蛋白免疫印跡和基因表達(dá)譜蛋白免疫印跡是根據(jù)抗原抗體的特異結(jié)合，檢測(cè)標(biāo)本中目的蛋白的方法，在特異性和靈敏度方面優(yōu)勢(shì)明顯。基因表達(dá)譜技術(shù)是采用cDNA 或核苷酸片段作探針制成芯片，用不同的熒光分子標(biāo)記待測(cè)標(biāo)本與對(duì)照樣品的mRNA 后與芯片雜交，通過記錄二者與芯片探針雜交的熒光強(qiáng)度來比較基因的表達(dá)水平。上述幾種方法均為新學(xué)科，可靠性高，操作簡(jiǎn)便。缺點(diǎn)是需要專用檢測(cè)設(shè)備、不易普及、價(jià)格昂貴等。

3 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)預(yù)后的影響

第八版肺癌腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis，TNM）分期更加細(xì)分了肺癌的分期標(biāo)準(zhǔn)。但淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移等危險(xiǎn)因素并未納入目前的TNM分期系統(tǒng)，對(duì)Ⅰ期NSCLC 的預(yù)后實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)預(yù)測(cè)還存在局限性，有關(guān)I 期非小細(xì)胞肺癌微轉(zhuǎn)移對(duì)患者的總生存期（overall survival，OS），無病生存期（disease free survival，DFS），無復(fù)發(fā)生存期（relapse free survival，RFS）的影響目前仍然存在爭(zhēng)議。

3.1 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)非小細(xì)胞肺癌OS 和DFS 及RFS 的影響為了明確早期非小細(xì)胞肺癌患者發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)預(yù)后的影響，Deng 等［9］篩選了1996-2016年已經(jīng)發(fā)布的8篇相關(guān)論文，發(fā)現(xiàn)在常規(guī)病檢陰性淋巴結(jié)中微轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為15.7%～44.9%。存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者的OS 與DFS 較無微轉(zhuǎn)移患者差，其合并HR 值分別為1.98（95%CI，1.50～2.62；P＜0.01）和2.34（95%CI，1.67-3.27；P＜0.01）。提示發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與腫瘤復(fù)發(fā)和患者的預(yù)后有關(guān)，對(duì)于術(shù)后淋巴結(jié)病理檢查陰性的早期NSCLC 患者也需要仔細(xì)隨訪。楊燕君等［10］以CK20和MUC1 作為標(biāo)記物采用RT-PCR 法檢測(cè)117 例pN0 期接受肺癌完全切除術(shù)后區(qū)域淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移，持續(xù)隨訪11～75 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間44 個(gè)月，評(píng)估淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與患者長(zhǎng)期生存的關(guān)系，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢出率21.37%（25/117），發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移組生存率明顯低于無微轉(zhuǎn)移組（χ2=4.127，P＜0.05）Lafuente-Sanchis 等［11］研究結(jié)果提示I 期NSCLC 患者發(fā)生前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與預(yù)后之間無顯著相關(guān)性。國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為，部分通過淋巴管轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞能激活機(jī)體的免疫應(yīng)答，這些腫瘤細(xì)胞可以在機(jī)體的免疫監(jiān)視下被抑制而保持靜止?fàn)顟B(tài)多年，其中自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫對(duì)腫瘤細(xì)胞監(jiān)視作用最明顯［12-13］。研究結(jié)果的矛盾性一方面與Meta分析本身的局限性、各研究組的研究條件不同（檢測(cè)指標(biāo)不盡相同）有關(guān)，另一方面有研究認(rèn)為只采用一種腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)肺癌微轉(zhuǎn)移的效果并不理想，所以多數(shù)研究者開始探索新的標(biāo)記物或結(jié)合使用多種腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)微轉(zhuǎn)移及肺癌早期診斷，以提高診斷的陽性率［14-15］。Ren 等［16］的研究結(jié)果再次證實(shí)了淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)患者生存期影響。常規(guī)病檢陰性淋巴結(jié)的NSCLC 患者中，陰性組與微轉(zhuǎn)移組相比，患者的RFS 及OS 明顯改善（5 年RFS：80%vs 25%，P＜0.01；5 年OS 87%vs 43%，P＜0.01），而淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者在RFS及OS方面優(yōu)于N1期患者（5年RFS 25%vs 8%；P=0.010）和OS（5 年OS：43%vs 20%；P＜0.01）。

3.2 不同區(qū)域淋巴結(jié)發(fā)生微轉(zhuǎn)移對(duì)于患者的預(yù)后的影響。研究統(tǒng)計(jì)顯示，不同區(qū)域的淋巴結(jié)如肺門區(qū)（N1）及縱隔區(qū)（N2）發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)患者的預(yù)后也存在差異。Jiang 等［17］對(duì)某三級(jí)醫(yī)院所有病理診斷為鱗狀細(xì)胞癌的患者行解剖性肺切除和系統(tǒng)縱隔淋巴結(jié)清掃的全部數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行回顧性收集，建立了一種NSCLC 區(qū)域淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)模型，提示N2淋巴結(jié)的隱匿性轉(zhuǎn)移對(duì)治療和生存至關(guān)重要。Martin 等［18］納入多機(jī)構(gòu)502 例臨床I 期（T1-2N0M0）NSCLC 患者的前瞻性試驗(yàn)中顯示NSCLC患者N2區(qū)域淋巴結(jié)中微轉(zhuǎn)移的存在與OS降低有關(guān)，而N1 區(qū)域淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與OS 與DFS 無明顯相關(guān)。陸薇等［19］應(yīng)用IH 對(duì)68 例I 期NSCLC 患者術(shù)后區(qū)域淋巴結(jié)進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行術(shù)后生存隨訪。結(jié)果顯示N2 區(qū)域發(fā)生微轉(zhuǎn)移患者的生存時(shí)間（40.2個(gè)月）明顯低于N1 區(qū)域發(fā)生微轉(zhuǎn)移患者（62.5 個(gè)月），N2 區(qū)域發(fā)生微轉(zhuǎn)移和N1+N2 區(qū)域發(fā)生微轉(zhuǎn)移患者的生存時(shí)間（36.6 個(gè)月）差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而僅N1區(qū)域發(fā)生微轉(zhuǎn)移與未發(fā)生微轉(zhuǎn)移患者生存時(shí)間（64.8 個(gè)月）差異不明顯，結(jié)果表明N2區(qū)域微轉(zhuǎn)移的患者生存時(shí)間較短，是影響患者預(yù)后的主要原因。

張浩業(yè)等［20］對(duì)54 例I 期NSCLC 患者淋巴結(jié)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示8例N1區(qū)域陽性患者與36例微轉(zhuǎn)移陰性患者的生存曲線對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.264，P=0.608），6 例N2 區(qū)域陽性患者與微轉(zhuǎn)移陰性患者對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（χ2=7.282，P＜0.01），顯示N2 區(qū)域發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，提示在臨床工作中，注意檢測(cè)N2區(qū)域淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)于指導(dǎo)患者進(jìn)行個(gè)體化的治療以及改善預(yù)后有重要意義。

Gwó?d? 等［21］對(duì)75 例病理I 期NSCLC 患者行經(jīng)頸縱隔擴(kuò)大淋巴結(jié)切除術(shù)及肺根治性切除術(shù)，9 枚縱隔淋巴結(jié)（9.3%）檢測(cè)出微轉(zhuǎn)移，該組患者的5 年DFS 和OS（21.4%）低于陰性組（61.8%，P＜0.01），再次說明縱隔淋巴結(jié)中微轉(zhuǎn)移的存在與I期NSCLC 患者OS和DFS下降有關(guān)。

3.3 I 期NSCLC 患者發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移接受術(shù)后輔助化療是否獲益目前對(duì)于中晚期的NSCLC患者術(shù)后接受輔助化療已經(jīng)寫入NCCN指南，但許多I期NSCLC 患者即使行腫瘤完全切除術(shù)，仍有復(fù)發(fā)，提示可能存在隱匿性轉(zhuǎn)移。而目前的指南中對(duì)存在隱匿性轉(zhuǎn)移的I期患者，沒有輔助治療的候選方案。

考慮到即使I 期的患者也有可能存在微轉(zhuǎn)移，West 等［22］認(rèn)為應(yīng)對(duì)所有NSCLC 根治術(shù)后的患者進(jìn)行輔助化療。歐陽偉煒等［23］研究結(jié)果也顯示，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)于淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性患者術(shù)后的輔助治療可獲益，術(shù)后放化療對(duì)于提高生存有益，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.063）。國(guó)外有研究通過檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的游離DNA（ctDNA）來識(shí)別肺癌術(shù)后患者體內(nèi)的微轉(zhuǎn)移，指出未來可以通過檢測(cè)ctDNA 來對(duì)早期微轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行個(gè)體化的輔助治療可能獲益［24］。王啟鳴［25］指出ctDNA 可能成為未來精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)背景下預(yù)測(cè)化療療效的研究方向。

Woodard 等［26］采用國(guó)際認(rèn)可的14 基因（BAG1，BRCA1，CDC6 和ERBB3 等）對(duì)100 例IA 期、IB 期和IIA 期非鱗狀非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行前瞻性風(fēng)險(xiǎn)分層，比較接受或不接受輔助化療的高?；颊叩臒o病生存（DFS），48 例（48%）患者經(jīng)分子檢測(cè)為高危，并將它們分配到觀察組和接受輔助化療組，發(fā)現(xiàn)未接受輔助治療的高危患者5 年DFS 估計(jì)為48.9%，接受化療的高?；颊? 年DFS 估計(jì)為91.7%（P＜0.01）。接受輔助化療的I 期NSCLC 患者5 年的DFS 明顯高于未接受輔助化療組。這項(xiàng)前瞻性研究初步證明對(duì)早期非鱗狀非小細(xì)胞肺癌的高危患者，進(jìn)行術(shù)后輔助化療，可以預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，改善預(yù)后。

4 展 望

近年來，對(duì)NSCLC 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是目前研究還存在著許多不足，目前大多數(shù)為回顧性研究，前瞻性研究甚少，發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對(duì)于患者遠(yuǎn)期預(yù)后仍不明確；對(duì)于發(fā)生微轉(zhuǎn)移的I期NSCLC 患者缺乏統(tǒng)一的早期干預(yù)方案，缺乏多中心協(xié)作的權(quán)威性研究。因此，應(yīng)進(jìn)一步研究I 期NSCLC 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與預(yù)后的關(guān)系，對(duì)今后將I期NSCLC 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)用于指引臨床診療，精準(zhǔn)判斷預(yù)后以及對(duì)高?；颊哌M(jìn)行早期干預(yù)具有重要意義。