張鳳梅，李可欣，余忠姝，張景勍，潘永全，韓文莉*

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶 400016； 2. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院重慶藥物高校工程研究中心，重慶 400016)

尼羅紅 [9-(二乙胺基)-5H-苯并[A]吩惡嗪-5-酮, Nile red, NR] 是一種脂溶性的熒光染料，與脂類物質(zhì)(包括甘油酯、磷脂以及各種脂肪酸)相結(jié)合后具有熒光效應(yīng)，在適合的波長(zhǎng)(450 ～ 580 nm)激發(fā)下可顯示強(qiáng)烈的桔紅色熒光(550 ～ 750 nm)，最初應(yīng)用于半定量技術(shù)[1]，目前被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、微藻、酵母和浮游植物等細(xì)胞中的脂類定量分析[2-5]。

近年來，納米制劑在藥物制劑領(lǐng)域?yàn)殚_發(fā)具有特定的靶向性藥物做出了較大的貢獻(xiàn)，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[6-7]。納米制劑包括脂質(zhì)體、膠束、微球、納米粒和納米囊等[8]。納米制劑具有通過改善藥物生物利用度、提高藥物穩(wěn)定性和抗癌藥物的靶向性停留來提高治療指數(shù)的特點(diǎn)[9-10]，還可增加疏水性藥物的溶解度并減少對(duì)正常組織的不良反應(yīng)[11-12]。為了追蹤給藥后納米制劑在細(xì)胞、組織、器官及生物體內(nèi)的分布，需要對(duì)納米制劑進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，通過相應(yīng)的成像技術(shù)進(jìn)行對(duì)比和分析[13]。

活體成像技術(shù)是利用活體生物發(fā)光或熒光成像直接監(jiān)測(cè)活細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)行為及跟蹤分子信號(hào)的一種新興的前沿技術(shù)[14]，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域[15-16]。活體成像技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)難以在活體觀察藥物動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)移過程的不足，對(duì)實(shí)時(shí)分析藥物在荷瘤小鼠體內(nèi)的靶向性具有重要的參考價(jià)值和指導(dǎo)意義[17]。

本研究擬將尼羅紅包裹入納米乳中，采用小動(dòng)物活體成像技術(shù)研究納米制劑的腫瘤靶向性及其在體內(nèi)的組織分布情況，以期為尼羅紅新的應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c裸鼠，4周齡，體重 (14.95 ± 0.64) g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK (京) 2014-0004】。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及操作嚴(yán)格按照 SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)要求在重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行【SYXK (渝) 2017-0023】。實(shí)驗(yàn)經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥品與試劑

尼羅紅 (Nile red, NR, 購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司)；尼羅紅混懸液 (NR suspension, NRS, 自制, 20170910)；尼羅紅油包水納米乳 [NR nano-emulsion, NRNE(O), 自制, 20170908][18]；胎牛血清 (Gibco)；RPMI-1640培養(yǎng)液 (HyClone)；Cell Counting Kit-8(日本同仁化學(xué)研究所)。

1.1.3 儀器

FA1004 A電子天平(上海精天電子儀器有限公司，中國(guó))；Thermo 311 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國(guó))；熒光分光光度計(jì)(島津公司，日本)；LB983 NC320型活體成像系統(tǒng)(Berthold Technologies GmbH & Co. KG，德國(guó))。

1.1.4 細(xì)胞

人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 NCI-H1688，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所胸外科饋贈(zèng)。H1688 細(xì)胞置于含 10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 H1688肺癌小鼠模型

人小細(xì)胞肺癌NCI-H1688細(xì)胞常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用培養(yǎng)液調(diào)整濃度至5×107個(gè)/ mL，在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.1 mL細(xì)胞懸液。每天觀察裸鼠的狀態(tài)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 尼羅紅熒光光譜特性

用熒光分光光度計(jì)考察尼羅紅的熒光光譜。

1.2.3 NRNE(O)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

通過CCK-8分析方法評(píng)價(jià)NRNE(O)對(duì)于NCI-H1688的毒性[19]。

1.2.4 活體成像實(shí)驗(yàn)

取皮下接種H1688細(xì)胞的裸鼠6只(腫瘤體積約為150 mm3)，隨機(jī)分為NRS組和NRNE(O)組，每組3只，按0.5 mol /只劑量分別灌胃NRS和NRNE(O)。分別在給藥前、給藥后1、3、5、12、24 h置于活體成像儀中進(jìn)行拍攝并統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度(counter per second，CPS，即單位時(shí)間內(nèi)電荷耦合元件(charge-coupled device, CCD)捕獲到的光子數(shù))拍攝模式為熒光模式，激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為620 nm，曝光時(shí)間為0.1 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Indigo 2.0軟件對(duì)熒光值進(jìn)行分析，利用SPSS 19.0軟件對(duì)裸鼠體重、腫瘤體積及熒光值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 尼羅紅的熒光光譜

如圖1 所示，尼羅紅具有良好的熒光光學(xué)特性，550 nm為最大激發(fā)波長(zhǎng)，620 nm為最大發(fā)射波長(zhǎng)。

圖1 尼羅紅的熒光光譜Figure 1 Fluorescence spectrum of Nile red

2.2 H1688肺癌小鼠模型的建立

裸鼠體重及腫瘤體積變化趨勢(shì)見圖2。接種H1688細(xì)胞后，裸鼠體重較穩(wěn)定表明裸鼠狀態(tài)較好，其腫瘤生長(zhǎng)速度由快到慢。

2.3 NRNE(O)的細(xì)胞毒性

采用CCK-8法，考察了NRNE(O)對(duì)H1688細(xì)胞的毒性。由圖3可以看出，當(dāng)NRNE(O)濃度約為500 μmol/L時(shí), 細(xì)胞的24 h存活率均高于85%。這說明NRNE(O)具有較低的細(xì)胞毒性和良好的生物相容性。

2.4 荷瘤裸鼠活體成像

各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)的成像結(jié)果如圖4所示， NRNE(O) 組腫瘤部位的熒光強(qiáng)度在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯強(qiáng)于NRS組(圖4紅色標(biāo)記部分為腫瘤)，NRNE(O) 組小鼠在給藥后3 h和5 h的熒光值均顯著高于NRS組(P< 0.01)。NRNE(O) 組于3 h在腫瘤部位的蓄積量最大，5 h后逐漸減少。而NRS組在腫瘤部位的幾乎無蓄積。隨著腫瘤體積的增加，其熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，表明尼羅紅可作為納米乳的示蹤劑(如圖4D所示)。

圖2 小鼠的體重及腫瘤生長(zhǎng)情況Figure 2 Changes in body weight (A) and tumor volume (B) of the H1688-bearing nude mice

圖3 不同濃度的NRNE(O)對(duì)H1688細(xì)胞存活率的影響Figure 3 Effects of different concentrations of NRNE(O) on the viability of lung cancer H1688 cells

注：A. NRS；B. NRNE(O)；C. 熒光強(qiáng)度 NRS and NRNE(O)；D. 腫瘤體積與光強(qiáng)度的線性關(guān)系；**P< 0.01 vs NRS。圖4 不同時(shí)間點(diǎn)尼羅紅原料藥與納米制劑在荷瘤裸鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布Note. A, NRS. B, NRNE(O). C, Fluorescence intensity of NRS and NRNE(O). D, Correlation between tumor volume and fluorescence intensity.**P< 0.01 vs NRS.Figure 4 Dynamic distribution of NRS and NRNE(O) in the H1688-bearing nude mice at different time points

3 討論

小動(dòng)物活體成像主要采用生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)，對(duì)疾病動(dòng)物模型微小病灶的檢測(cè)靈敏度極高[20]。該技術(shù)能夠進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的動(dòng)物活體觀察，從而對(duì)同一實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的觀察，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體間差異。與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法相比，可大大減少動(dòng)物的用量，符合替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則[21]，同時(shí)也為確定藥物在體內(nèi)是否具有靶向性，提供了新的技術(shù)手段。在體內(nèi)紅光的穿透性比藍(lán)綠光的穿透性強(qiáng)，所以近紅外熒光為成像觀察的最佳選擇。本研究就是利用了熒光染料尼羅紅近紅外成像的特性，得到了荷瘤鼠體內(nèi)的納米乳清晰、實(shí)時(shí)的熒光分布圖。

本課題組前期將尼羅紅導(dǎo)入納米乳中，采用激光共聚焦觀察納米乳進(jìn)入A549活細(xì)胞的情況。結(jié)果顯示，納米乳在10 min內(nèi)迅速進(jìn)入細(xì)胞，主要集中在細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)分布在胞核內(nèi)[18]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)：尼羅紅可作為一種納米制劑的示蹤劑應(yīng)用于細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中。尼羅紅測(cè)定細(xì)胞中三酰甘油的含量時(shí)，在一定范圍內(nèi)(0 ～ 800 μg/mL)，其熒光值與尼羅紅成濃度依賴關(guān)系，當(dāng)尼羅紅濃度再增大時(shí)，其熒光值呈下降趨勢(shì)[22]。本實(shí)驗(yàn)中采用前期制備方法將終濃度為2 mg/mL的尼羅紅包裹于納米乳中[18]，通過小動(dòng)物活體成像技術(shù)快速穩(wěn)定地指示納米乳的分布狀況，下一步將對(duì)尼羅紅適用于活體成像的濃度范圍及其濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系進(jìn)行研究。

本研究利用尼羅紅的熒光特性結(jié)合小動(dòng)物活體成像技術(shù)，成功地將尼羅紅作為納米乳的示蹤劑應(yīng)用到考察其在荷瘤鼠體內(nèi)的腫瘤靶向性和組織分布中。從荷瘤裸鼠活體成像圖看出，NRS組的藥物在腫瘤部位幾乎沒有蓄積，NRNE(O)組的藥物在腫瘤部位有蓄積，表明該納米乳給藥系統(tǒng)顯著提高了其腫瘤靶向性。本研究拓展了尼羅紅的應(yīng)用范圍，也證實(shí)尼羅紅可作為示蹤劑與活體成像技術(shù)結(jié)合，為納米制劑在小動(dòng)物活體內(nèi)成像提供了重要的研究手段。

參考文獻(xiàn)

[1] Huang GH, Chen G, Chen F. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence [J]. Biomass Bioenerg, 2009, 33(10): 1386-1392.

[2] Kimura K, Yamaoka M, Kamisaka Y. Rapid estimation of lipids in oleaginous fungi and yeasts using Nile red fluorescence [J]. J Microbiol Methods, 2004, 56(3): 331-338．

[3] Bertozzini E, Galluzzi L, Penna A, et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red [J]. J Microbiol Methods, 2011, 87(1): 17-23．

[4] 胡小文, 馬帥, 弓淑芬, 等. 熒光光譜法檢測(cè)微藻中油脂[J]. 中國(guó)油脂, 2011, 36(4): 70-74.

Hu XW, Ma Shuai, Gong SF, et al. Determination of microalgae lipids by fluorescent spectrometry [J]. Chin Oils Fats, 2011, 36(4): 70-74.

[5] 王海英, 符茹, 黃寶祥. 基于尼羅紅熒光染色的小球藻脂質(zhì)快速檢測(cè)方法研究 [J]. 中國(guó)油脂, 2012, 37(3): 78-81．

Wang HY, Fu R, Huang BX. Rapid determination of lipid in Chlorella based on Nile red fluorescence [J]. Chin Oils Fats, 2012, 37(3): 78-81.

[6] Su J, Chen F, Cryns VL, et al. Catechol polymers for pH-responsive, targeted drug delivery to cancer cells [J]. J Am Chem Soc, 2011, 133(31): 11850-11853.

[7] 高會(huì)樂, 蔣新國(guó). 新型藥物遞釋系統(tǒng)的研究進(jìn)展 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 52(2): 181-188.

Gao HL, Jiang XG. The progress of novel drug delivery systems [J]. Acta Pharm Sin, 2016, 51: 272-280.

[8] Song G, Suzuki OT, Santos CM, et al. Gulp1 is associated with the pharmacokinetics of PEGylated liposomal doxorubicin (PLD) in inbred mouse strains [J]. Nanomedicine, 2016, 12(7): 2007-2017.

[9] 李大偉, 武玉敏, 劉正平,等. 肺部吸入納米制劑治療肺癌的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥房, 2016, 27(31): 4460-4462．

Li DW, Wu YM, Liu ZP, et al. Research progress of lung inhalation nano-agents for treating lung cancer [J]. Chin Pharm, 2016, 27(31): 4460-4462．

[10] 孔曉龍, 郭梅紅, 范穎, 等. 納米靶向制劑的研究進(jìn)展 [J]. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 32(4): 682-685．

Kong XL, Guo MH, Fan Y, et al. Research progress of targeting nanodrug delivery system [J]. J Guangxi Med Univ, 2015, 32(4):682-685．

[11] 劉源, 周建平, 王偉. 聚乙二醇修飾靶向納米制劑的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 48(3): 268 -275.

Liu Y, Zhou JP, Wang W. Advances in PEGylated targeted nano-preparation [J]. J Chin Pharm Univ, 2017, 48(3): 268 -275.

[12] 史一杰, 程剛. 納米制劑生物安全性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展 [J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 27(12): 987-992.

Shi YJ, Cheng G. Review on the research of biological safety evaluation for nanopreparations [J]. J Shenyang Pharm Univ, 2010, 27(12): 987-992.

[13] 胡秀麗, 王瑞, 岳軍, 等. 葉酸高分子納米膠束在小鼠體內(nèi)的靶向分布 [J]. 中國(guó)科學(xué):化學(xué), 2012, 42(8): 1172-1178.

Hu XL, Wang R, Yue J, et al. Folic acid mediated tumor targeting effect observed by fluorescent imaging [J]. Sci Sin (Chim), 2012, 42(8): 1172-1178.

[14] Ntziachristos V, Ripoll J, Wang LV, et al. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging [J]. Nat Biotechnol, 2005, 23(3): 313-320．

[15] 邰文, 孫敏敏, 劉楠, 等. 應(yīng)用動(dòng)物活體生物發(fā)光技術(shù)觀察紫杉醇混合膠束的抑瘤效果[J].藥學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 45(4): 530-534.

Tai W, Sun MM, Liu N, et al. Study on the anti-tumor effect of paclitaxel mixed micelle by using in vivo optical imaging technique [J]. Acta Pharm Sin, 2010, 45: 530-534.

[16] 沈錦秋, 甘勇, 甘莉, 等. 氟比洛芬酯眼用納米乳-離子敏感型原位凝膠的研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 45(1): 120-125.

Shen JQ, Gan Y, Gan L, et al. Ion-sensitive nanoemulsion-insitugel system for ophthalmic delivery of flurbiprofen axetil [J]. Acta Pharm Sin, 2010, 45: 120-125.

[17] 張勝華, 程昕, 鐘根深, 等. 活體成像分析異硫氰酸熒光素標(biāo)記Rituximab 在荷淋巴瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布 [J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 90(33): 2367-2370.

Zhang SH, Cheng X, Zhong GS, et al.Invivoimaging analysis of biodistribution of FITC-labeled Rituximab in lymphoma-bearing nude mice [J]. Natl Med J Chin, 2010, 90(33): 2367-2370.

[18] Liu S, Chen D, Yuan Y, et al. Efficient intracellular delivery makes cancer cells sensitive to nanoemulsive chemodrugs [J]. Oncotarget, 2017, 8(39): 65042-65055.

[19] Münch C, Harper JW. Mitochondrial unfolded protein response controls matrix pre-RNA processing and translation [J]. Nature, 2016, 534(7069): 710-713.

[20] 付奎, 楊曉峰, 汪海龍, 等. 活體熒光成像評(píng)估Ag85A和Ag85BDNA疫苗對(duì)小鼠膀胱癌移植瘤的療效 [J]. 中國(guó)腫瘤生物學(xué)雜志, 2009, 16(6): 588-594.

Fu K, Yang XF, Wang HL, et al. In vivo fluorescence image analysis system in assessing efficacies of pVAX1-Ag 85A and pVAX1-Ag 85B DNA vaccines in treatment of bladder cancer cell implanted tumors in mice [J]. Chin J Cancer Biother, 2009, 16(6): 588-594.

[21] 閆明霞, 劉蕾, 莢德水, 等. 人肺癌裸小鼠模型活體成像的動(dòng)態(tài)觀察 [J]. 腫瘤, 2008, 28(10): 833-836.

Yan MX, Liu L, Jia DS, et al. Dynamic observation of in vivo biofluorescence imaging in nude mouse model with human lung carcinoma [J]. Tumor, 2008, 28(10): 833-836.

[22] Gao Y, Chen G, Weselake RJ. A rapid Nile red fluorescence-based method for triacylglycerol content in microspore-derived cell suspension cultures of brassica napus [J]. Lipids, 2014, 49(11): 1161-1168.