王茂春，段維旺，李凱，周宇荀，肖君華

(東華大學(xué)生物研究所，上海 201620)

哺乳動(dòng)物的肢體發(fā)育是一個(gè)自身基因按時(shí)空被嚴(yán)格調(diào)控表達(dá)的過程，涉及細(xì)胞增殖、分化、遷徙和凋亡[1-6]。其中，Hox、Fgfs和Shh等信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用。模式動(dòng)物的研究表明，這些通路相關(guān)基因突變會(huì)造成的肢體發(fā)育缺陷。Hoxd12、13突變小鼠表現(xiàn)出前肢腕骨、掌骨和指骨不同程度的畸形[7-8]。小鼠Hoxa和Hoxd基因簇發(fā)生缺失突變時(shí)，小鼠肢體在發(fā)育早期停止發(fā)育，表現(xiàn)出嚴(yán)重的肢體遠(yuǎn)端組織的缺失，并且Shh的信號(hào)通路無法生成[9]。在人類中存在因肢體發(fā)育異常造成的出生缺陷，美國(guó)疾病控制中心(CDC)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在美國(guó)每年約有1500 例上肢缺陷和700 例下肢缺陷新生兒，發(fā)病率達(dá)到了0.02% ～ 0.04%[10]。對(duì)于肢體發(fā)育的研究越來越受到生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的重視。

關(guān)于前后肢發(fā)育是如何被分別調(diào)控的，相關(guān)的研究目前較少。Logan等[11]通過雞胚模型研究表明，將該后肢發(fā)育的信號(hào)來源極化活性區(qū)移植到前肢，會(huì)誘導(dǎo)異位的后肢結(jié)構(gòu)。已有的文獻(xiàn)表明，通過雞胚和小鼠等模型的研究發(fā)現(xiàn)前后肢的形態(tài)分別受Tbx5/4基因所影響，Tbx5 基因的產(chǎn)物與前肢發(fā)育有關(guān)，而Tbx4 基因產(chǎn)物與后肢的發(fā)育相關(guān)[12-14]。Nemec等[15]研究表明后肢特異表達(dá)的Pitx1基因?qū)τ诤笾螒B(tài)的形成起著重要的作用。

本研究通過小鼠前后肢基因表達(dá)譜芯片差異基因的聚類分析及信號(hào)通路分析，獲得后肢特異表達(dá)核心基因，并通過qPCR驗(yàn)證部分基因，為哺乳動(dòng)物肢體發(fā)育研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)C57BL/6 J小鼠(3只雄鼠，體重24 ～ 26 g；6只雌鼠，體重18 ～ 20 g)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2017-0005】，飼養(yǎng)于東華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房【SYXK (滬) 2014-0022】，環(huán)境溫度20 ～ 24℃，相對(duì)濕度40% ～ 70%，期間給予充足的飼料及潔凈飲用水。小鼠飼料為上海普路騰生物科技有限公司生產(chǎn)的輻照大小鼠繁殖料【滬飼證(2014)04001】。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均得到東華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：東華倫審[2018] 6號(hào))。

1.1.2 主要試劑及儀器

Trizol試劑(Invitrogen公司，美國(guó))，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))，SuperReal PreMix Plus qPCR試劑(天根生化科技有限公司，中國(guó))。

Nanodrop 2000c核酸定量?jī)x(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))，PCR儀(Bio-Rad公司，美國(guó))，7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提

實(shí)驗(yàn)鼠采用一雄兩雌的方式合籠，次日清晨通過觀察陰栓判定孕期，如果見栓記為0.5 d，在雌鼠懷孕10.5 d時(shí)，使用脊椎脫臼法犧牲母鼠，剖取胎小鼠，使用Trizol試劑抽提胎鼠前后肢胚芽RNA，使用Nanodrop 2000c進(jìn)行RNA濃度及純度的檢測(cè)，RNA保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 芯片數(shù)據(jù)下載

小鼠前后肢基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)下載于National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus(NCBI GEO)數(shù)據(jù)庫(GSE30138)。

1.2.3 基因表達(dá)驗(yàn)證

采用Thermo Fisher Scientific公司的First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，按照操作說明進(jìn)行1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄，包括3個(gè)前肢胚芽RNA及3個(gè)后肢胚芽RNA。使用ddH2O將得到的cDNA進(jìn)行5倍稀釋。按照下列體系進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，包括：10 μL SuperReal PreMix Plus，0.4 μL Rox，2.5 μL cDNA模板，300 nmol/L的上下游引物，補(bǔ)水至20 μL，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。采用兩步法PCR反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性2 min；95℃ 15 s，62℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)。結(jié)果使用相對(duì)定量的方法進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異統(tǒng)計(jì)分析，P< 0.001差異有顯著性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Transcriptome Analysis Console軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)(5個(gè)前肢E10.5 d芯片及4個(gè)后肢E10.5 d芯片)進(jìn)行質(zhì)控，利用差異倍數(shù)為2倍以上或0.5倍以下及P值小于0.05進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，使用軟件的Volcano Plot及Hierarchical Clustering功能進(jìn)行差異表達(dá)基因的火山圖繪制及聚類分析。根據(jù)聚類分析結(jié)果將后肢特異表達(dá)的差異基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能分析，將后肢特異表達(dá)的差異基因?qū)隚eneminia數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基因分子網(wǎng)絡(luò)繪制。

2 結(jié)果

2.1 小鼠前后肢差異表達(dá)基因及功能分析

為了了解哺乳動(dòng)物前后肢基因表達(dá)譜差異及差異基因的生物學(xué)功能，我們首先將芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢查及標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)比分析前肢及后肢組間差異表達(dá)的基因。差異基因分析結(jié)果如圖1所示，以差異倍數(shù)為2倍以上或0.5倍以下及P值小于0.05進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，小鼠胚胎E10.5 d后肢相較于前肢差異表達(dá)的基因共有275個(gè)：其中紅色的點(diǎn)表示上調(diào)的基因，共45個(gè)；藍(lán)色的點(diǎn)表示下調(diào)的基因，共230個(gè)。將差異基因列表導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO分析，結(jié)果如表1所示，這些差異表達(dá)的基因主要涉及基因的轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、多器官的發(fā)育、骨骼系統(tǒng)的發(fā)育、細(xì)胞粘連和細(xì)胞分化等方面的功能。

表1 差異表達(dá)基因參與的前15個(gè)生物過程Table 1 Top 15 biological processes involving the differentially expressed genes

圖1 前后肢差異表達(dá)基因的火山圖Figure 1 Volcanic map of the differentially expressed genes in the fore and hind limbs

2.2 聚類分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)后肢特異表達(dá)的基因，我們將差異表達(dá)的基因進(jìn)行了層次聚類分析。層次聚類分析結(jié)果如圖2所示，我們可以看到前后肢差異表達(dá)基因可以分為4個(gè)cluster， cluster 1顯示前肢和后肢表達(dá)量都較高，cluster 2顯示前肢和后肢表達(dá)量都較低，cluster 3顯示前肢表達(dá)量較高，后肢表達(dá)量較低，cluster 4顯示后肢表達(dá)量高，前肢表達(dá)量低。同一天相較于前肢，后肢在特異表達(dá)的基因?qū)τ诤笾l(fā)育起到更突出的作用。

2.3 分子網(wǎng)絡(luò)圖

為了了解后肢特異表達(dá)的差異基因在分子層面相互作用關(guān)系，我們通過聚類分析，將cluster 4僅在后肢特異表達(dá)的基因進(jìn)行基因相互作用分子網(wǎng)絡(luò)圖的繪制(圖3)。共表達(dá)前十個(gè)基因?yàn)椋篣pk3b、Aldh1a2、Hoxb9、Hoxc9、Tcf3、Gata6、Prrx2、Crmp1、Pitx1、Agrp；基因相互作用核心節(jié)點(diǎn)前十個(gè)基因：Ifi204、Skor1、Tle1、Rxra、Rarb、Lhx3、Ldb1、Lbx1、Isl1、Gata6。

圖2 前后肢差異表達(dá)基因?qū)哟尉垲惙治鰺釄DFigure 2 Heat map of hierarchical analysis of the differentially expressed genes between the fore and hind limbs

2.4 qPCR驗(yàn)證

我們從基因相互作用分子網(wǎng)絡(luò)圖中，隨機(jī)挑選了Hoxc10、Hoxc9、Pitx1基因進(jìn)行qPCR檢測(cè)，以及在cluster3中前肢特異表達(dá)的Tbx5基因作為陰性對(duì)照。qPCR結(jié)果如圖4所示，在小鼠胚胎期E10.5 d，后肢特異的Hoxc10、Hoxc9、Pitx1基因的表達(dá)量相較于前肢分別提高了397.4倍、5.5倍及59.2倍，陰性對(duì)照前肢特異的Tbx5基因，后肢表達(dá)量?jī)H僅為前肢的0.03倍，結(jié)果表明qPCR結(jié)果真實(shí)可靠。再與芯片結(jié)果比較，后肢相較于前肢Hoxc10、Hoxc9、Pitx1及Tbx5基因的Fold Change值分別為42.5(上調(diào))、4.9(上調(diào))、33.7(上調(diào))及-16.7(下降)，qPCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致，說明芯片結(jié)果可靠。

3 討論

小鼠在胚胎發(fā)育過程中，在胚胎期E10.5 d開始出現(xiàn)后肢的胚芽形態(tài)，多種基因及信號(hào)因子的開始表達(dá)，調(diào)控后續(xù)肢體的位置及形態(tài)[16-17]。利用這一特征，我們通過小鼠胚胎期E10.5 d前后肢表達(dá)譜芯片篩選出275個(gè)差異表達(dá)的基因，而這些基因在基因的轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、多器官的發(fā)育、骨骼系統(tǒng)的發(fā)育、細(xì)胞粘連和細(xì)胞分化等方面發(fā)揮著重要的功能。其中，大部分生物學(xué)功能集中于基因的轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控中，包括基于DNA的轉(zhuǎn)錄過程和基于DNA的翻譯過程等，表明之所以后肢相對(duì)于前肢位置及形態(tài)上會(huì)有差別，是因?yàn)楹笾l(fā)育還受到多種基因轉(zhuǎn)錄過程中轉(zhuǎn)錄因子及基因翻譯過程中信號(hào)因子的表達(dá)調(diào)控。

將差異表達(dá)的基因進(jìn)行了層次聚類分析，其中后肢特異表達(dá)的cluster 4中的基因，通過MGI人類/小鼠疾病模型數(shù)據(jù)庫的搜索，我們發(fā)現(xiàn)Aldh1a2、Hoxc9、Gata6、Pitx1等14個(gè)基因都與肢體、骨骼發(fā)育缺陷的疾病模型相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。Niederreither等[18]研究發(fā)現(xiàn)Aldh1a2基因的突變會(huì)導(dǎo)致小鼠后肢的完全缺失。Kozhemyakina等[19]研究發(fā)現(xiàn)條件敲除Gata6基因的小鼠后肢的前端會(huì)發(fā)生Shh信號(hào)及下游基因紊亂表達(dá)，并在后肢前端出現(xiàn)多趾頭的性狀。Marcil等[20]研究發(fā)現(xiàn)Pitx1和Pitx2基因的純合突變會(huì)導(dǎo)致小鼠后肢股骨縮短、腓骨及脛骨形態(tài)的異常、以及腳趾缺失。

圖3 后肢特異表達(dá)的基因相互作用分子網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 Network diagram of the gene interaction molecules specifically expressed in the hind limbs

為了更好的認(rèn)識(shí)后肢區(qū)別于前肢分子水平的表達(dá)變化及重要的核心基因，我們對(duì)后肢特異表達(dá)的基因進(jìn)行了分子網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。從圖3中，我們可以看出這些基因在分子網(wǎng)絡(luò)上的相互作用關(guān)系，機(jī)制復(fù)雜，大部分基因涉及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。其中，我們挑選了在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控上具有代表性的Hoxc10、Hoxc9、Pitx1這3個(gè)基因，在表達(dá)水平上進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，其結(jié)果與芯片結(jié)果一致，表明芯片結(jié)果可靠。并通過已有研究顯示Tbx4和Pitx1基因都是已知的特異調(diào)控后肢形態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子[11,15]。因此，分子網(wǎng)絡(luò)中的這些基因?qū)椴溉閯?dòng)物后肢形態(tài)形成的發(fā)育調(diào)控研究提供重要的依據(jù)。

綜上所述，本研究通過小鼠前后肢基因表達(dá)譜芯片差異基因的聚類分析及信號(hào)通路分析，獲得后肢特異表達(dá)核心基因，并通過qPCR驗(yàn)證部分基因，為哺乳動(dòng)物肢體發(fā)育研究提供基礎(chǔ)。

注：后肢特異的Hoxc10、Hoxc9、Pitx1基因的表達(dá)量相較于前肢分別提高了397.4倍、5.5倍及59.2倍，而前肢特異的Tbx5基因，后肢表達(dá)量?jī)H為前肢的0.03倍。P< 0.001。圖4 qPCR檢測(cè)前后肢Hoxc10、Hoxc9、Pitx1及Tbx5基因相對(duì)表達(dá)水平Note. The expression levels of hindlimb-specific Hoxc10, Hoxc9, and Pitx1 genes were 397.4-fold, 5.5-fold, and 59.2-fold higher than those in the forelimbs, respectively, while the forelimb-specific Tbx5 gene was only 0.03 times in the hind limbs than in the fore limbs. P< 0.001.Figure 4 Relative expression levels of Hoxc10, Hoxc9, Pitx1 andTbx5 genes between the fore and hind limbs with qPCR detection

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