盧美歡 李利軍 馬英輝

摘要：為探索馬鈴薯病害生物防治和抗病育種的有效途徑，構(gòu)建馬鈴薯病程相關(guān)蛋白StPR-1b的pET30A原核表達(dá)體系，用鎳柱分離純化該融合蛋白，結(jié)果表明，經(jīng)0.5 mmol/L 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)后，StPR-1b蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達(dá);純化得到預(yù)期大?。s15 ku）的融合蛋白;StPR-1b蛋白對(duì)馬鈴薯軟腐病病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌有一定的抑制作用，蛋白濃度越大，抑制效果越強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：StPR-1b蛋白;原核表達(dá);馬鈴薯;抑菌作用;胡蘿卜軟腐果膠桿菌

中圖分類號(hào)： S435.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0085-03

病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，簡(jiǎn)稱PRP或PRs）是指植物在病理或病理相關(guān)的環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生的，普遍存在的具有廣譜抗性的誘導(dǎo)的可溶性蛋白質(zhì)，是植物產(chǎn)生誘導(dǎo)抗病性的一種生化機(jī)制。PRP相對(duì)分子質(zhì)量為10～40 ku，積累于病原侵染寄主植物部位和未侵染部位的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間，主要通過固化寄主細(xì)胞壁、提高抗菌活性和參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)化等方式參與植物的誘導(dǎo)抗病性[1-2]，能夠抵抗蛋白酶、糖苷酶、重金屬、尿素、低pH值和高溫（60 ℃）等逆境環(huán)境，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性[3-6]。大多數(shù)PRP具有幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性，在植物體內(nèi)和體外顯示出抗真菌活性，與植物過敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive response，簡(jiǎn)稱HR）和系統(tǒng)獲得性抗性（systematic acquired resistance，簡(jiǎn)稱SAR）有密切關(guān)系，PRP在寄主中的誘導(dǎo)表達(dá)常作為SAR建立的標(biāo)志[7]，因此人們可通過構(gòu)建PRP基因的方法獲得抗菌譜廣、作用持久的抗病新品種。

馬鈴薯軟腐病是馬鈴薯產(chǎn)區(qū)發(fā)生最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，在苗期和窖藏期容易發(fā)生，馬鈴薯是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物和蔬菜品種，營(yíng)養(yǎng)豐富，產(chǎn)量很高，但目前我國(guó)多數(shù)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)都受到了馬鈴薯軟腐病的嚴(yán)重威脅，對(duì)我國(guó)馬鈴薯的生產(chǎn)造成極大的破壞，2000年福建省福鼎市馬鈴薯軟腐病發(fā)生面積為25107 hm2，是總種植面積的82%，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[8]。

本研究對(duì)病程相關(guān)蛋白StPR-1b 進(jìn)行原核表達(dá)，通過構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)將融合蛋白大量表達(dá)和分離純化，探索該蛋白對(duì)馬鈴薯軟腐病病原菌的抑制作用，以期開發(fā)安全無害的抗生素，并為該基因在馬鈴薯抗病育種中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料 馬鈴薯軟腐病病原菌、表達(dá)載體pET30a載體、pET30A-StPR-1b質(zhì)粒，均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;表達(dá)宿主為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2 酶和試劑 T4連接酶、DNA Marker、NdeⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶，均購(gòu)自TaKaRa公司;凝膠回收試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG），購(gòu)自Sigma公司;PVDF膜，購(gòu)自Millpore公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)StPR-1b基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Rrimer 5.0設(shè)計(jì)合成引物，引物序列：上游5′-GACACGACACCATATGCAGAACTCTCCGCAGGATTAT-3′，下游5′-GTGTCCTCGAGGTACGGACGCTGACCAACCCAG-3′，以含StPR-1b全長(zhǎng)的pET30A-StPR-1b質(zhì)粒為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。

1.2.2 PCR反應(yīng)條件 以pET30A-StPR-1b質(zhì)粒為模板，在總體積為50 μL的EP管中依次加入1 μL dNTP（25 mmol/L）、5 μL高溫聚合酶（Pfu） Buffer（10×）、2 μL上游引物、2 μL下游引物、0.4 μL Pfu（5 U/μL），用ddH2O補(bǔ)至50 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性22 s，53 ℃退火20 s，72 ℃ 延伸60 s，24個(gè)循環(huán)，72 ℃修復(fù)延伸5 min。

1.2.3 PCR電泳及回收 將PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液，電壓為150 V，電流為100 mA條件下，20 min電泳觀察。將目的條帶切下，按試劑盒回收StPR-1b片段，回收純化好的片段備用酶切。酶切體系為1 μg純化回收好的片段、5 μL酶切Buffer（10×）、1 μL限制性內(nèi)切酶NdeⅠ（10 U/μL）和1 μL限制性內(nèi)切酶XhoⅠ（10 U/μL），用ddH2O補(bǔ)至50 μL，在溫度為37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h。

1.2.4 目的片段與載體連接、轉(zhuǎn)化和篩選 回收純化好的目的DNA片段8 μL、T4連接酶Buffer 2 μL、pET30A載體4 μL、T4連接酶1 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL，在16 ℃條件下反應(yīng) 4 h;然后將其轉(zhuǎn)入oneshort感受態(tài)細(xì)胞中，檢測(cè)篩選出陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的菌液使用質(zhì)粒提取試劑盒SK8191 SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA。

1.2.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用NdeⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶對(duì)測(cè)序正確的pET30A-StPR-1b質(zhì)粒和表達(dá)載體pET30A分別進(jìn)行雙酶切，切膠回收目的片段用T4 DNA連接酶連接到pET30a（+）載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到oneshort感受態(tài)細(xì)胞中，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)證實(shí)含目的基因的片段已經(jīng)插入原核表達(dá)載體中并成功轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌中，得到重組表達(dá)載體。

1.2.6 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 挑取表達(dá)菌株的單菌落于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min下過夜培養(yǎng)。然后按1 ∶ 100稀釋培養(yǎng)液，在37 ℃、220 r/min下培養(yǎng)至D600 nm為0.6時(shí)，添加終濃度為 0.5 mmol/L 的IPTG，在 220 r/min，溫度分別為20、37 ℃條件下誘導(dǎo)過夜;37 ℃誘導(dǎo) 4 h，以未加IPTG誘導(dǎo)劑的處理作為陰性對(duì)照。4 000 r/min離心10 min收集菌體，棄上清，菌體用500 μL PBS（pH值為7.4）緩沖液懸浮，添加終濃度為 0.5 mmol/L 的溶菌酶，超聲破碎6 min，破碎0.5 s停1.5 s，分別離心收集上清和沉淀，沉淀用500 μL包涵體溶解液（8 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，pH值為8.0）溶解，分別取40 μL樣品和10 μL 5×protein loading buffer混勻，沸水浴10 min，離心后取上清，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡(jiǎn)稱SDS-PAGE）檢測(cè)。準(zhǔn)備12%的SDS-PAGE，Tris-Gly電泳緩沖液（Tris 3.0 g，甘氨酸14.4 g，SDS 1.0 g，定容至1 L），上樣量為10 μL，濃縮膠條件：80 V 20 min，分離膠條件：120 V 60 min，凝膠電泳結(jié)束用考馬斯亮藍(lán)染色20 min，脫色后觀察蛋白條帶。

將培養(yǎng)的菌液按1 ∶ 100比例接種于3 L含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)，當(dāng)D600 nm達(dá)到 0.6 時(shí)，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，在 20 ℃、220 r/min條件下誘導(dǎo)過夜，離心收集細(xì)胞菌體，采用鎳瓊脂糖親和層析進(jìn)行蛋白純化后，-80 ℃保存。

1.2.7 蛋白免疫印記試驗(yàn)（Western Blot） 將純化好的 HIS-StPR-1b蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，蛋白經(jīng)過SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，用5%的脫脂奶粉，在37 ℃條件下緩慢振蕩2 h，加兔抗his標(biāo)簽的一抗（1 ∶ 500稀釋）在37 ℃條件下緩慢振蕩 60 min。加羊抗兔的二抗孵育60 min，最后用3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色鑒定。

1.2.8 純化的HIS-StPR-1b蛋白對(duì)馬鈴薯軟腐病病原菌的抑制試驗(yàn) 將HIS-StPR-1b蛋白用無菌雙蒸水配制成 1 mg/mL 蛋白溶液，再稀釋成不同濃度梯度備用。將保存的馬鈴薯軟腐病病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌活化，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。在已滅菌的EP離心管中加入880 μL液體LB培養(yǎng)基，20 μL軟腐病病原菌菌液，同時(shí)加入稀釋好的HIS-StPR-1b蛋白溶液100 μL，32 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，每個(gè)濃度做3次重復(fù)，測(cè)定D600 nm。同時(shí)做空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 StPR-1b原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以pET30a-StPR-1b質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的417 bp條帶（圖1），對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行瓊脂糖電泳、回收?；厥债a(chǎn)物亞克隆于pET30a載體中。對(duì)含有StPR-1b基因的重組pET30a質(zhì)粒進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，PCR檢測(cè)和酶切鑒定結(jié)果顯示，StPR-1b基因已成功導(dǎo)入到原核表達(dá)載體pET30a中，目標(biāo)片段大小與該基因編碼區(qū)大小一致。

2.2 StPR-1b蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將原核表達(dá)載體pET30a-StPR-1b轉(zhuǎn)化至大腸桿菌oneshort感受態(tài)細(xì)胞，在IPTG誘導(dǎo)下StPR-1b能成功表達(dá)，菌體中檢測(cè)到高表達(dá)量的蛋白條帶（圖2的泳道3和泳道5）?？疾觳煌瑴囟日T導(dǎo)StPR-1b蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，在20、37 ℃ 2個(gè)溫度處理中，37 ℃誘導(dǎo)更有利于StPR-1b蛋白的表達(dá)。表明不同誘導(dǎo)溫度對(duì)StPR-1b蛋白表達(dá)的影響較明顯。

2.3 純化蛋白SDS-PAGE分析

采用鎳瓊脂糖親和層析對(duì)在大腸桿菌中大量表達(dá)的重組StPR-1b蛋白進(jìn)行純化，采用不同濃度的咪唑基（Imidazole）洗脫液洗脫，發(fā)現(xiàn)20 mmol/L Imidazole洗脫組分能較好地將StPR-1b蛋白分離純化（圖3），收集蛋白洗脫液冷凍干燥，經(jīng)檢測(cè)蛋白濃度為84%。StPR-1b融合蛋白經(jīng)過純化，SDS-PAGE 電泳分析在約15 ku出現(xiàn)明顯條帶，表明融合蛋白成功得到了純化（圖4）。

2.4 StPR-1b融合蛋白的Western Blot分析

為了進(jìn)一步確定StPR-1b融合蛋白是否在大腸桿菌中成功表達(dá)，用抗his標(biāo)簽的一抗和加羊抗兔的二抗進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，用TMB顯色鑒定。結(jié)果表明，在預(yù)期的 15 ku 位置有特異性條帶出現(xiàn)（圖5），證明StPR-1b融合蛋白表達(dá)成功。

2.5 StPR-1b蛋白對(duì)馬鈴薯軟腐病病原菌的抑制作用

配制不同濃度StPR-1b融合蛋白溶液，研究其對(duì)軟腐病病原菌的抑制作用。結(jié)果（圖6）顯示，在0.005～0.08 mmol/L蛋白溶液濃度范圍內(nèi)，His-StPR-1b融合蛋白對(duì)馬鈴薯軟腐病病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌有一定的抑制作用，蛋白濃度越大，抑制效果越強(qiáng)，當(dāng)His-StPR-1b融合蛋白濃度為 0.08 mmol/L 時(shí)，抑制率達(dá)到90.0%。

3 結(jié)論

馬鈴薯軟腐病在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，是馬鈴薯產(chǎn)區(qū)發(fā)生最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)量。積極培育抗病品種，是緩解馬鈴薯軟腐病的有效途徑。本研究通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，將StPR-1b基因成功在大腸桿菌中得到表達(dá)。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，不同誘導(dǎo)條件對(duì)StPR-1b蛋白表達(dá)的影響較明顯，本研究經(jīng)多次誘導(dǎo)及SDS-PAGE分析后發(fā)現(xiàn)，StPR-1b蛋白最佳誘導(dǎo)溫度為37 ℃，采用鎳親和層析進(jìn)行蛋白純化，最佳純化條件為20 mmol/L Imidazole洗脫組分，獲得了純度為84%的蛋白，這為進(jìn)一步研究StPR-1b蛋白的生物活性及在馬鈴薯抗病方面的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

植物在受到真菌、細(xì)菌和病毒等病原體入侵時(shí)合成抗毒素、抗菌肽或一些病程相關(guān)蛋白，PRs與寄主植物抗病性和系統(tǒng)獲得性具有密切關(guān)系，是植物自我抗御機(jī)制中的可誘導(dǎo)組分，目前已知的蛋白根據(jù)序列同源性、血清學(xué)關(guān)系和生物活性被劃分為17個(gè)家族。抗病防衛(wèi)反應(yīng)中表達(dá)的基因主要是編碼病程相關(guān)蛋白和植保素合成相關(guān)酶基因，而PRs在植物抗病性和系統(tǒng)獲得抗性中起重要作用，是因?yàn)椴煌琍Rs基因的表達(dá)水平和抗病性之間緊密相關(guān)。StPR-1b蛋白屬于 PR-1 家族成員，StPR-1b基因編碼1個(gè)含有159個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在N端存在長(zhǎng)為24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。本研究通過PCR技術(shù)擴(kuò)增了馬鈴薯病程相關(guān)蛋白 StPR-1b基因，并使克隆的StPR-1b基因在大腸桿菌中得到成功表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)體系為純化產(chǎn)物驗(yàn)證體外生物活性及后期培育抗病轉(zhuǎn)基因馬鈴薯提供了參考。

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收稿日期：2018-10-31

基金項(xiàng)目：陜西省科學(xué)院科技計(jì)劃（編號(hào)：2015K-05）;陜西省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)計(jì)劃（編號(hào)：2014K02-13-02、2016NY-197）;西安市科技局農(nóng)業(yè)創(chuàng)新計(jì)劃[編號(hào)：2017050NC/NY009（4）]。

作者簡(jiǎn)介：盧美歡（1981—），女，廣東羅定人，碩士，副研究員，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：lu_meihuan@sina.com。

通信作者：李利軍，研究員，主要從事微生物物資開發(fā)與利用研究。E-mail：lijun_lli@163.com。