羅濤，柴娟，經(jīng)屏

單純皰疹病毒腦炎（herpes simplex virus encephalitis，HSE）是 由單 純 皰疹 病 毒（herpes simplex virus，HSV）引起的腦部炎癥，是非流行性腦炎中最常見的類型。HSV是嗜神經(jīng)的DNA病毒，分為1、2兩個(gè)抗原亞型，近90%的HSE是由HSV-1引起。除病毒直接損傷神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞外，病毒導(dǎo)致的免疫炎性反應(yīng)也有關(guān)鍵作用。研究認(rèn)為固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答在機(jī)體抗病毒感染過程中發(fā)揮了重要作用[1]。

證據(jù)表明 Toll樣受體（(Toll-like receptors，TLRs）介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在機(jī)體抗病毒感染過程中發(fā)揮重要作用[2]。HSV感染過程中大量促炎細(xì)胞因子的釋放是導(dǎo)致HSE腦損傷的主要原因。TLRs可能參與或介導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)HSV-1病毒的識(shí)別、對(duì)HSV-1感染的固有免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)過程。本研究將通過HSV-1感染小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2建立HSE的細(xì)胞模型，觀察干預(yù)前后細(xì)胞TLRsmRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

BV2細(xì)胞購(gòu)于北京協(xié)和醫(yī)院；HSV-1病毒由武漢協(xié)和醫(yī)院病毒室提供；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶（含EDTA）購(gòu)自Hyclone公司，噻唑藍(lán)、二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Total RNA提取試劑（RNAiso Plus）、5×PrimeScript?RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）購(gòu)于日本TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 BV2細(xì)胞上HSV-1病毒滴度測(cè)定 BV2細(xì)胞以1×104的密度接種于96孔板，培養(yǎng)至單層生長(zhǎng)，吸去培養(yǎng)液，接種連續(xù)10倍系列稀釋的病毒維持液（5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基+稀釋病毒），感染病毒孔加入含100μL病毒液的維持液，對(duì)照孔加入100μL維持液，每組5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察并記錄出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)。細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）劃分標(biāo)準(zhǔn)：25%細(xì)胞病變（+）；25%～50%細(xì)胞病變（++）；50%～75%細(xì)胞病變（+++）；75%～100%細(xì)胞病變（++++）。當(dāng)細(xì)胞病變不再發(fā)展時(shí)，采用Reed-Muench法計(jì)算50%組織細(xì)胞感染量（tissue culture infective dose 50，TCID50）。LgTCID50=距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對(duì)數(shù)，距離比例=(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)－50%)/(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)－低于50%病變率的百分?jǐn)?shù))。

1.2.2 分組及處理 將BV2細(xì)胞以1×105的密度接種于6孔板內(nèi)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)60%時(shí)，隨機(jī)分為對(duì)照組和HSV-1感染組。感染組予HSV-1病毒液（100TCID50），病毒作用6 h后更換培養(yǎng)基，各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞形態(tài)并收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)的測(cè)定。

1.2.3 各組TLR2、TLR3、TLR9轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

RNA制備試劑盒提取組織總RNA，采用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒檢測(cè)各組TLR2、TLR3和TLR9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，以三磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）為內(nèi)參對(duì)照。反應(yīng)條件：95℃變性4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。每樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，StepOne Software 2.1軟件（Applied Biosystems公司）分析PCR過程各檢測(cè)樣本的Ct（Threshold cycle）值，Ct值代表熒光實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果，ΔCT=CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)，ΔΔCT=ΔCT(感染組)-ΔCT(對(duì)照組)。根據(jù)公式計(jì)算相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSV-1病毒對(duì)BV2細(xì)胞滴度測(cè)定

HSV-1感染BV2細(xì)胞后，CPE表現(xiàn)為細(xì)胞折光性增強(qiáng)，突起增多，胞質(zhì)內(nèi)可見空泡，細(xì)胞間距增大。本研究將對(duì)數(shù)滴度的HSV-1感染BV2后，記錄48 h內(nèi)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，TCID50=10-4.8/0.1mL，見表1。

表1 對(duì)數(shù)滴度的HSV-1感染BV2細(xì)胞48 h后CPE變化

2.2 HSV-1感染后BV2細(xì)胞TLR2、TLR3、TLR9轉(zhuǎn)錄水平變化

HSV-1感染組TLR2、TLR3、TLR9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），見圖2。

3 討論

HSE是臨床上多發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，HSV-1是引起非流行致命病毒腦炎的最常見原因[3]。目前認(rèn)為HSE的發(fā)生可能與病毒復(fù)制的直接作用有關(guān)，還與病毒感染機(jī)體后誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)有關(guān)[4]。HSV-1侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后小膠質(zhì)細(xì)胞立即被激活，激發(fā)機(jī)體固有免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)復(fù)雜的免疫應(yīng)答過程，釋放一系列炎癥介質(zhì)。TLRs是一類可激活人體固有免疫應(yīng)答并在感染早期發(fā)揮保護(hù)性作用的重要膜受體家族[5]，小膠質(zhì)細(xì)胞自身有多種TLRs位于細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)。病毒的核酸或包膜，作為一種病原體相關(guān)分子模式，可以被TLRs識(shí)別結(jié)合，啟動(dòng)機(jī)體的先天免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)[6]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)11種人類TLRs和13種小鼠TLRs。TLRs主要特征為胞外區(qū)有富含亮氨酸的重復(fù)序列（leucine rich repeat，LRR）以及胞內(nèi)區(qū)有與白介素-I型受體同源的Toll/白介素-1受體（Toll/interleukin-1 receptor，TIR）結(jié)構(gòu)域。LRR與識(shí)別病原體特異結(jié)構(gòu)有關(guān)，TIR是TLRs下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要原件。一旦它們與HSV-1蛋白或病毒核酸這樣的病原體結(jié)合，機(jī)體的先天免疫反應(yīng)被激活，核因子Kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38蛋白激酶相繼被激活，從而引起趨化因子、促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[8]。

研究表明，有多種TLRs參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染引起的免疫反應(yīng)。肺炎鏈球菌腦膜炎中發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR4和TLR9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加，大腸埃希菌腦膜炎中TLR2、TLR4和TLR7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加[8]。人類TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9及鼠TLR3、TLR4、TLR7和TLR9能觸發(fā)I型干擾素的合成和釋放，在抗病毒免疫中起關(guān)鍵作用[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)干擾素-α/β受體缺陷時(shí)，感染HSV-2的缺陷小鼠較野生鼠生殖道病毒復(fù)制和疾病進(jìn)展顯著加快，當(dāng)給予TLR3、TLR7和TLR9的激活劑（合成的雙鏈RNA，咪喹莫特和寡核苷酸）后，缺陷小鼠的病毒復(fù)制，疾病進(jìn)展和死亡率無明顯改善，而感染HSV-2的野生鼠卻有明顯改善，結(jié)果表明對(duì)抗HSV的干擾素的產(chǎn)生是由TLR3、TLR7和TLR9介導(dǎo)的[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)在HSV-1感染小膠質(zhì)細(xì)胞后，感染組TLR2、TLR3及TLR9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組明顯增加，說明TLR2、TLR3和TLR9可能參與了小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)HSV-1病毒的識(shí)別。研究結(jié)果表明Toll樣受體參與了HSE的發(fā)病，尤其是TLR2、TLR3和TLR9介導(dǎo)了機(jī)體對(duì)HSV-1感染的先天免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)過程。小膠質(zhì)細(xì)胞受HSV-1病毒感染后，可能通過TLR2、TLR3和TLR9激活先天免疫反應(yīng)，釋放一些細(xì)胞因子參與病毒感染后的病理生理過程。但TLRs在病毒感染后所起的作用仍有爭(zhēng)議，有報(bào)道TLR2激活后產(chǎn)生的過度炎性反應(yīng)對(duì)HSE是有害的[4]，另有報(bào)道TLR2可協(xié)同TLR9對(duì)HSE產(chǎn)生保護(hù)作用[11,12]。因此，TLRs在HSE發(fā)病過程中作用和機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。