金光軍 周冰之 張建成

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)發(fā)病過程中會伴隨血管痙攣、肺血管重塑及肺血栓等癥狀，從而導(dǎo)致肺血管阻力加強產(chǎn)生肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)[1]。研究表明，在PAH的發(fā)病過程中，肺血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞的過度增殖引起的血管重塑是肺動脈高壓疾病發(fā)病的重要緣由[2]。

近年來研究表明吸煙可導(dǎo)致肺血管重構(gòu)，其主要機制可能是吸煙產(chǎn)生的煙霧促使人的肺動脈平滑肌細胞(human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs)的狀態(tài)發(fā)生改變后產(chǎn)生異樣增殖并向內(nèi)膜遷移[3～5]。微小RNA (microRNA,miRNA)是一種非編碼RNA約為22～28個核苷酸長，在真核生物中廣泛存在[6]。miRNA的異常表達與平滑肌的生理狀態(tài)及PAH有著緊密的關(guān)聯(lián)[7～9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21可通過負調(diào)控PTEN(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten)的表達量，影響PASMCs的增殖和凋亡[10]。PTEN作為抑癌基因，可以使磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸[phosphatidylinositol(3,4,5)-t risphosphate, PIP3]去磷酸化來抑制PI3K/AKT 通路[11～14]。筆者初步研究發(fā)現(xiàn)，香煙提取物(cigarette smoke extract,CSE)誘導(dǎo)PASMCs的增殖和遷移增加，miR-21表達增加，抑制miR-21表達能抑制香煙提取物誘導(dǎo)的PASMCs增殖和遷移。本研究通過過表達和敲降miR-21看其在CSE誘導(dǎo)的PASMCs 是否通過影響PTEN/PI3K/AKT通路而影響了PASMCs 細胞的增殖，遷移的能力。

材料與方法

1.材料：健康SD大鼠，體質(zhì)量200±20g;武漢卷煙廠生產(chǎn)紅雙喜牌過濾嘴香煙,每支含尼古丁 1.0mg、焦油15mg；DMEM美國購于Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol、 Opti-MEM 培養(yǎng)基均來自美國 Invitrogen 公司；All-in-OneTMmiRNAQ- PCR Detection Kit購于上海伯易生物有限公司；miR-21引物和U6 siRNA 引物由上海生工公司合成;α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體、PCNA、Bcl-2、AKT、P-AKT、PTEN、caspase-3以及β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)粉末來自美國Sigma公司;Transwell小室購于美國 Costar 公司。

2.分離原代鼠肺動脈平滑肌細胞培養(yǎng)及鑒定：參照文獻[15]并稍做修改，超凈臺內(nèi)用纖維器械在無菌PBS中將肺動脈3 級以下的分支取下，取下后刮除血管內(nèi)外膜，放入含有膠原酶Ⅰ的離心管中進行消化，在CO2培養(yǎng)箱中消化2～4h,分離得到PASMCs。消化所得細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、CO2含量5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并對所得細胞進行細胞形態(tài)學(xué)和α-SMA IF及免疫細胞化學(xué)(1∶1000)進行鑒定。原代培養(yǎng)到3～6代的PASMCs可用于實驗。

3.CSE 制備及干預(yù)：CSE制備參照文獻[16]并做適當(dāng)修改。將去除過濾嘴的香煙點燃，負壓將煙霧吸入到含有DMEM培養(yǎng)基的封閉的玻璃瓶，輕輕晃動它解散，用氫氧化鈉將溶液pH值調(diào)至7.4，經(jīng) 0.22μm微孔濾膜過濾得到 100%的 CSE原液。CSE原液用完全培養(yǎng)基稀釋成10%用于后續(xù)實驗。

4.miRNA轉(zhuǎn)染PASMCs：將miR-NC、miR-21、anti-miR-NC、anti-miR-21干粉離心后用125μl RNase-free H2O 配制成20μmol/L的儲存液。轉(zhuǎn)染步驟如下：接種2×105細胞到24孔板中，用無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，棄原培養(yǎng)液，PBS清洗兩邊后換成400μl在37℃ 溫育的opti-MEM培養(yǎng)基。 準(zhǔn)備A、B兩個EP管，A管中加入47.5μl opti-MEM后加25μl濃度為20μmol/L的miR-21，B管中將2μl 轉(zhuǎn)染試劑(Lipo2000)加入到48μl轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基optiMEM，A、B管輕輕混合后室溫孵育5 min；將B管液體加入到A管中輕輕混勻室溫放置20min后，將混合液加入24孔板，充分混合；37℃，培養(yǎng)6h；加入1ml正常生長液含雙倍血清，不移除轉(zhuǎn)染混合物孵育24h；換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后分別提取RNA和蛋白進行檢測。

5.Real-time PCR檢測miRNA-21表達：Trizol提取4組實驗細胞總RNA，加入等體積的異丙醇沉淀RNA，DEPC水溶解后，測定RNA 的純度，測定后取部分RNA跑瓊脂糖凝聚電泳進行質(zhì)檢。取2μl總RNA，應(yīng)用All-in-OneTMmiRNAQ- PCR Detection Kit進行RT- PCR 檢測，每樣品測3 次,實時定量檢測。miRNA-21引物序列為：5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGAAAA-3′。Real-time分析采用2-△△CT方法。

6.Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達量變化：取對數(shù)生長期的PASMCs懸液接種在6孔板，進行實驗干預(yù)后提取總蛋白。用BCA法進行蛋白定量，定量后跑膠，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)完膜后室溫用TBST配制5%BSA 封閉將膜放入其中搖床封閉1h，一抗4℃搖床孵育過夜。次日，回收一抗，TBST溶液洗滌3次，每次5min,室溫二抗搖床孵育1h，二抗回收后再次用TBST溶液洗3次，洗完后膜用Odyssey掃膜儀掃膜，保存結(jié)果用軟件進行灰度分析。

7.MTT檢測細胞增殖：胰酶消化轉(zhuǎn)染4組miRNA后的細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×104/孔，輕輕混勻，加入到96孔板中，在相應(yīng)刺激下培養(yǎng)48h后， 拿出96孔板，每孔加用無酚紅培養(yǎng)基配制的MTT 10μl(5mg/ml，即0.5%MTT)。在37℃孵育4h，將150μl二甲基亞砜溶液加入到各孔。孵育15min。微孔板每孔吸光度在570nm，空白為0。

8.劃痕實驗檢測PASMCs的遷移能力：先在6孔板背后劃線，然后分別消化轉(zhuǎn)染4種miRNA的細胞，并以5×105個細胞數(shù)量加入到6孔板中，當(dāng)細胞融合到約90%時，單層培養(yǎng)細胞沿培養(yǎng)基的底部放置，并用滴管槍頭作為0h的時間點，在顯微鏡下記錄劃痕區(qū)域的寬度。除去培養(yǎng)液，用含10%CSE的10%胎牛血清培養(yǎng)基在劃痕后繼續(xù)培養(yǎng)至24h。利用Image J 軟件統(tǒng)計計算，并記錄。

9.Transwell實驗檢測PASMCs的遷移能力：制備處于生長對數(shù)期的原代細胞懸液，24孔板中每孔加0.5ml，對細胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后將4組細胞用胰酶消化后細胞計數(shù)板計數(shù)，用只含10%CSE的DMEM培養(yǎng)液重懸并將細胞濃度調(diào)整為2×108/L，上室每孔加0.1ml制備好的的細胞懸液，下室每孔中加0.5ml完全培養(yǎng)液。10%CSE刺激24h后，用甲醛固定30min后風(fēng)干，將細胞用0.1%結(jié)晶紫染色20min，棉簽輕輕擦去小室上層細胞后，400倍顯微鏡下隨機挑選5個視野進行統(tǒng)計分析計算細胞數(shù)量。

結(jié) 果

1.RT-PCR 檢測 miR-21 mRNA 表達：如圖1所示，過表達miR-21組的miR-21含量明顯高于轉(zhuǎn)染miR-NC組(P=0.000)。而轉(zhuǎn)染anti-miR-21組miR-21的表達量明顯低于轉(zhuǎn)染anti-miR-NC組(P=0.000)。

圖1 RT-PCR檢測miR-21 mRNA結(jié)果A.過表達miR-21;B.敲降miR-21

2.Western blot法檢測miR-21對CSE誘導(dǎo)的PASMCs中PTEN/PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響：如圖2所示，10%CSE 處理后轉(zhuǎn)染miR-21和轉(zhuǎn)染miR-NC的PASMCs相比，PTEN蛋白表達量下降，從而P-AKT顯著上升，同時與增殖相關(guān)的PCNA及Bcl-2的表達量增加，而凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達量下降。而轉(zhuǎn)染anti-miR-21組與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC組相比,PTEN表達量上升，P-AKT顯著下降，從而使PCNA和Bcl-2的表達量下降而caspase-3表達量上升。

圖2 miR-21對CSE 誘導(dǎo)的PASMCs 中PTEN/PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白表達量的影響

3.miR-21對 CSE 誘導(dǎo)的細胞增殖的影響：如圖3所示,與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-21后MTT檢測A值升高(P<0.01),而轉(zhuǎn)染anti-miR-21組與對照組比較，MTT檢測A值降低(P<0.01)。

圖3 miR-21對 CSE 誘導(dǎo)的細胞增殖的影響

4.miR-21對 CSE 誘導(dǎo)的細胞遷移的影響：如圖4所示，轉(zhuǎn)染了miR-21的細胞經(jīng)24h培養(yǎng)后其劃痕愈合速度較快，劃痕愈合情況明顯優(yōu)于miR-NC組(P<0.01)， 而轉(zhuǎn)染了anti-miR-21組的細胞劃痕愈合速度較轉(zhuǎn)染anti-miR-NC 組相比較慢(P<0.01)。圖5可見miR-21 轉(zhuǎn)染組的細胞穿膜數(shù)量明顯多于 miR-NC組(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染anti-miR-21組的細胞穿膜數(shù)量明顯少于anti-miR-NC組(P<0.05)。

圖4 細胞劃痕實驗結(jié)果A.細胞劃痕實驗照片(×200);B.細胞劃痕實驗量化圖

圖5 transwell實驗結(jié)果A.轉(zhuǎn)染miR-21/miR-NC和轉(zhuǎn)染anti-miR-21/anti-miR-NC 細胞培養(yǎng)36h后transwell小室下層細胞結(jié)晶紫染色觀察(×200);B.Transwell 實驗量化圖

討 論

COPD在發(fā)病的過程中，往往伴隨著并發(fā)癥PAH，而PAH形成的病理學(xué)基礎(chǔ)是血管重構(gòu)。PASMCs的異常增殖、分化和遷移在肺血管重構(gòu)中發(fā)揮著重要作用[17]。各種相關(guān)因子的平衡失調(diào)導(dǎo)致PASMCs的異常增殖或遷移，最終導(dǎo)致肺血管中層增厚，管腔狹窄或閉塞，形成PAH[18,19]。Wright 等報道，長期暴露于香煙煙霧的豚鼠出現(xiàn)肺動脈管壁增厚現(xiàn)象，PASMCs增殖并向內(nèi)膜遷移，肺小動脈的肌化是造成肺血管結(jié)構(gòu)改變的重要機制[20]。microRNA作為一種非編碼RNA,其作用是通過堿基互補配對的原則和mRNA的3′UTR區(qū)域發(fā)生不同程度的互補結(jié)合，從而使目標(biāo)mRNA翻譯受抑制或降解，進而影響細胞的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在受傷的血管平滑肌中上調(diào)，參與了血管重構(gòu)的過程。而在目前miRNA的研究過程中，關(guān)于miR-21的研究較多，大量實驗證實miR-21是唯一一個幾乎在所有實體癌(甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)腸癌細胞、肝癌細胞等)中過表達的miRNA[21～23]。

實驗表明，在血管損傷導(dǎo)致的再狹窄中miRNA-21異常高表達，同時，有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21可通過對PTEN的負調(diào)控來提高PASMCs的增殖能力并抑制其凋亡。同時在頸動脈損傷中miR-21上調(diào)，導(dǎo)致PETN表達下降，促進了PASMCs的增殖[12]。2011年，美國學(xué)者認為miR-21與PTEN的mRNA的3′-UTR存在的結(jié)合位點[22]。在結(jié)腸癌患者中，miR-21與PTEN結(jié)合后使PTEN的表達量改變而影響細胞的增殖遷移。PTEN作為一種抑癌基因參與并影響了PI3K磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3′kinase，PI3K)/AKT(又稱protein kinase B,PKB)信號通路的活化。PTEN與PI3K的產(chǎn)物PIP3結(jié)合從而去磷酸化PIP3，使PIP3處于低活化狀態(tài)從而抑制AKT的活化，來降低PI3K/AKT信路通路活化水平。該通路被稱為PTEN/PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[24,25]。該通路不只和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著緊密的聯(lián)系，同時很大程度的影響了PASMCs的增殖遷移。在PASMCs中，香煙提取物致使PTEN 失活從而活化PI3K/AKT通路,活化的AKT可以促使眾多蛋白發(fā)生磷酸化修飾，從而促進細胞的增殖，遷移侵襲，抑制凋亡。因此筆者推測miR-21能通過負調(diào)控PTEN而活化PI3K/AKT通路促進PASMCs的增殖遷移從而參與PAH的形成。

本研究用通過在PASMCs中成功過表達和敲降miR-21并用10%CSE處理后通過WB檢驗發(fā)現(xiàn)在過表達miR-21后，PTEN蛋白含量減少，使AKT的磷酸化水平提高，而提高了增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達量和Bcl-2的蛋白含量，而凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達量明顯下降。而在轉(zhuǎn)染anti-miR-21后，與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC比較，PTEN蛋白表達量上升從抑制了AKT的磷酸化導(dǎo)致了PCNA和Bcl-2的表達量下降，而使caspase-3的表達量有所提升。同時，過表達miR-21組細胞的MMT值明顯上升，細胞的增殖速度加快，遷移能力增強。而敲降miR-21后MMT值比對照組下降，細胞的增殖速度變慢，遷移能力減弱。

綜上所述，在CSE刺激的PASMCs中，miR-21可以通過負向調(diào)控PTEN的表達量從而使PI3K/AKT通路活化，正向調(diào)控了香煙煙霧誘導(dǎo)的PASMCs的增殖和遷移。本研究為闡明吸煙致肺動脈高壓的機制, 尋找新的治療手段提供了實驗依據(jù)。