白明煥，耿 毅，*，鄧龍君，甘維熊，周 劍，黃小麗，陳德芳，歐陽萍，趙若璇，諶冰潔

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.雅礱江流域水電開發(fā)有限公司，四川 成都 610056； 3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，四川 成都 611731)

惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)屬假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、假單胞菌屬(Pseudomonas)，革蘭陰性桿菌，廣泛分布于土壤、水體中，是一種條件致病菌，可感染兩棲類、魚類和甲殼類等多種水生動物?，F(xiàn)已有大鯢(Andriasdavidianus)[1]、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[2]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[3]、條石鯛(Japaneseparrotfish)[4]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[5]、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergiideman)[6]、黑鯛(Sparusmacrocephlus)[7]、雜交鱘(hybrid sturgeon)[8]、雜交鲇(hybrid catfish)[9]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[10]及虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[11]等感染，并引起全身多器官出血、壞死，甚至死亡的報道。

長薄鰍(Leptobotiaelongata)為鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae)、薄鰍屬(Leptobotia)魚類，俗名花鰍、紅沙鰍鉆等，是中國的特有物種，主要分布于長江宜賓江段及其臨近水域。魚體兩側(cè)有鮮艷的花斑，具有極高的觀賞價值，同時其肉富含蛋白質(zhì)、脂肪、必需氨基酸以及人體所需的鈣磷等常量元素[12]，是觀賞和食用價值兼?zhèn)涞拿F魚類。隨著長江流域的過度捕撈以及大量水利工程的修建，導(dǎo)致長薄鰍的棲息地環(huán)境遭到破壞，其資源量和漁獲量不斷下降，已被列入《中國瀕危動物紅皮書》和《中國物種紅色名錄》。近年來，隨著長薄鰍人工繁殖的成功，其養(yǎng)殖逐漸興起，并被列為重要的增殖放流對象。2017年8月，四川省西昌市某養(yǎng)殖場的長薄鰍陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病死亡，主要表現(xiàn)為體表潰爛、出血等癥狀，為明確其病因，本研究從自然發(fā)病魚體內(nèi)進行了病原菌的分離，并通過表型特性測定、16S rRNA和gyrB基因序列分析確定其病原為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，同時進行了病理損傷觀察，以期為長薄鰍疾病的診斷和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病魚，體質(zhì)量355.3～426.8 g，采自四川省西昌市某養(yǎng)殖場；健康魚，體質(zhì)量112.7～131.6 g，購于四川省宜賓市某養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑

LB培養(yǎng)基、細菌基因組提取試劑盒、藥敏紙片、細菌生化微量鑒定管、PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒。

1.3 剖檢變化與組織病理學(xué)觀察

對病魚進行系統(tǒng)解剖，對各組織、器官的病理損傷觀察，并取鰓絲、鰭條以及體表黏液進行寄生蟲檢查。同時取患病魚的心、肝、脾、腎等組織，4%的甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察其組織學(xué)損傷。

1.4 病原菌分離及形態(tài)觀察

無菌條件下，從病魚的肝、脾與腎等取樣，LB平板上畫線，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。挑取形狀、大小、顏色均勻一致的優(yōu)勢單個菌落再次接種LB平板進行純化培養(yǎng)，并觀察菌落與細菌形態(tài)特征。獲得純化后的菌株4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 生理生化測定及藥敏試驗

生理生化特性采用微量生化法參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]進行。藥敏試驗采用K-B法進行，將新鮮菌液用無菌棉簽均勻涂布于MH平板，28 ℃培養(yǎng)24 h測定抑菌圈的直徑并判定結(jié)果，敏感度根據(jù)杭州微生物試劑有限公司提供的標準進行判定。

1.6 人工感染試驗

將分離菌接種于LB肉湯，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后用麥氏比濁法將菌液濃度調(diào)至3.0×108、3.0×107、3.0×106和3.0×105CFU·mL-1，健康長薄鰍于水溫(20±1)℃中暫養(yǎng)7 d后，腹腔注射菌液0.2 mL·尾-1，每組20尾；對照組注射等量的生理鹽水。接種后每天觀察魚的臨床表現(xiàn)及死亡情況，試驗期14 d。對感染后的病死魚及時進行解剖，并進行細菌的分離鑒定。

1.7 16S rRNA和gyrB基因序列測定及系統(tǒng)進化分析

取對數(shù)生長期新鮮菌液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用16S rRNA的通用引物[14]與gyrB基因的通用引物[15](表1)分別進行PCR擴增。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 2 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，共35次循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將純化回收的PCR產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。將獲得的分離菌16S rRNA與gyrB基因序列和已知GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，使用MEGA 7.1用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1細菌16S rRNA和gyrB基因引物序列

Table1Primer sequence of bacterial 16S rRNA andgyrBgene

引物Primer序列Sequence(5′-3′)DNA片段DNA fragments/bp16S ForwardAGAGTTTGATCCTGGCTCAG150016S ReverseGGCTACCTTGTTACGACTTgyrB ForwardGAAGGCGGNACNCAYGAAG1200gyrB ReverseCTTCRTGNGTNCCGCCTTC

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀與剖檢變化

發(fā)病長薄鰍表現(xiàn)為食欲不振，游動緩慢，常浮于水面。病魚的鰓蓋邊緣及胸鰭基部出血及潰瘍灶，胸腹部點狀出血，體表尤其是尾部見大小不等的潰爛，病程長的病例在潰瘍灶可見水霉著生(圖1-A)。剖檢見鰓絲充血、腫脹，呈深紅色；肝淤血、腫大，質(zhì)脆，呈花斑狀(圖1-B)，脾與腎腫大，呈暗紅色；胃腸道空虛，腸腔內(nèi)充有較多的黏液。鰓絲壓片與體表黏液涂片鏡檢，未發(fā)現(xiàn)寄生蟲。

2.2 病原菌分離及形態(tài)觀察

從發(fā)病長薄鰍肝、腎與脾內(nèi)分離獲得3株優(yōu)勢菌(BMH170819、BMH170820、BMH170821)，28 ℃培養(yǎng)24 h后，在LB培養(yǎng)基上形成表面濕潤光滑，微隆起，邊緣整齊，直徑1.5～2.5 mm的淡黃色半透明的菌落。3株菌經(jīng)革蘭氏染色均呈G-桿菌，大小為0.5～1.0 μm×1.5～4.0 μm(圖2)。

A，鰓蓋邊緣潰瘍，胸鰭基部與胸部出血；B，肝淤血，腫大。A， Ulcers were on the edge of the operculum and punctate hemorrhage were at the base of the pectoral fin and the breast; B， Congestion and swelling of liver.圖1 患病長薄鰍的剖檢變化Fig.1 Gross lesions of diseased Leptobotia elongate

2.3 分離菌生理生化特性及藥敏試驗

分離菌的主要生理生化特性見表2，3株分離菌的主要生化特性相同且與惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的生理生化特性基本一致，初步判定其為P.putida。藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，3株菌均對新霉素、慶大霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、強力霉素等敏感，對氨芐西林、阿莫西林、林可霉素、氟苯尼考、克林霉素等耐藥，詳見表3。

圖2 分離株革蘭氏染色形態(tài)Fig.2 Micrograph of strain in Gram staining

2.4 分離菌人工感染試驗

由于3株分離菌的生理生化特性及藥物敏感性完全一致，故選其中一株(BMH170820)進行人工感染試驗。攻毒24 h后，細菌濃度為3.0×108、3.0×107CFU·mL-1試驗組的長薄鰍出現(xiàn)采食量下降、游動無力等臨床癥狀，濃度為3.0×106、3.0×105CFU·mL-1的長薄鰍陸續(xù)從注射后的3～4 d開始出現(xiàn)臨床癥狀。隨著病情的發(fā)展，發(fā)病長薄鰍的體表開始出現(xiàn)出血點、潰瘍、爛斑、鰭條出血等。濃度為3.0×108CFU·mL-1的試驗組，從第3天開始出現(xiàn)死亡，其余組則在感染后4～5 d開始出現(xiàn)死亡，到試驗結(jié)束時，各感染組的死亡率分別為85%、65%、30%和10%；而對照組的長薄鰍在試驗期間無異常。從人工感染發(fā)病死亡的長薄鰍體內(nèi)再次分離細菌，獲得與感染接種菌形態(tài)、理化特性及16S rRNA基因序列一致的菌株。

2.5 16S rRNA和gyrB基因序列測定及系統(tǒng)進化分析

采用擴增16S rRNA基因和gyrB基因的通用引物，分別擴增得到1 500、1 200 bp的片段，純化測序后將序列提交NCBI獲得GenBank登錄號分別為MH155971和MH396435。將獲得的16S rRNA和gyrB基因序列與GenBank中已有的序列進行Blast比對，結(jié)果顯示，菌株BMH170820與數(shù)據(jù)庫中的惡臭假單胞菌同源性最高。在基于分離菌的16S rRNA和gyrB序列與GenBank中已有的假單胞菌屬細菌16S rRNA及gyrB基因序列建立的系統(tǒng)進化樹上(圖3)，該分離菌株與P.putida聚為一族。

表2分離株BMH170819-BMH170821生理生化特性

Table2Biochemical and physiological characteristics of isolated strain BMH170819-BMH170821

試驗項目ItemsBMH170819-BMH170821P. putida[13]P. putida[9]運動性 Motility++N/A精氨酸雙水解酶 Arginine dihydrolase+++鳥氨酸脫羧酶 Ornithine decarboxyla---賴氨酸脫羧酶 Lysin decarboxylase---接觸酶 Catalase++N/A脲酶 Urease--+氧化酶 Oxidase+++H2S 產(chǎn)生 H2S production---檸檬酸鹽 Citrate+++吲哚反應(yīng) Indole test---甘露醇Mannitol---明膠 Gelatin---硝酸鹽還原 Nitrate reduction+++V-P 試驗 V-P test---半乳糖ONPG-N/A-葡萄糖產(chǎn)氣 Glucose gas--N/A甲基紅 Methyl red---麥芽糖 Maltose---木糖 Xylose--+果糖 Fructose++N/A

+，陽性反應(yīng)；-，陰性反應(yīng)；N/A，未測定。

+， Positive; -， Negative; N/A， No determination.

表3分離株BMH170819-BMH170821的藥敏試驗結(jié)果

Table3Antibiotics sensitivities of the isolated strain BMH170819-BMH170821

藥敏種類Drugs判斷標準Standard/mm耐藥(R)中敏(I)敏感(S)抑菌圈直徑Diameter of inhibitory zone/mm結(jié)果Result新霉素Neomycin≤1213～16≥1718S慶大霉素Gentamicin≤1213～14≥1524S氨芐西林Ampicillin≤1314～16≥170R阿莫西林Amoxicillin≤1314～17≥180R四環(huán)素Tetracycline≤1415～18≥1926S氧氟沙星Ofloxacin≤1213～15≥1630S頭孢氨芐Cefalexin≤1415～17≥180R多粘菌素B Polymyxin B≤89～11≥1217S恩諾沙星Enoxacin≤2122～28≥2930S林可霉素Lincomycin≤2324～30≥310R鏈霉素Streptomycin≤1112～14≥1516S諾氟沙星Norfloxacin≤1213～16≥1728S丁胺卡那Amikacin≤1415～16≥1726S青霉素Penicillin≤1920～27≥280R紅霉素Erythromycin≤1314～22≥230R氟苯尼考Florfenicol≤1213～17≥180R克林霉素Clindamycin≤1415～20≥210R強力霉素Doxycycline≤1213～15≥1626S

S，敏感；I，中度敏感；R，耐藥。

S， Sensitive; I， Moderately sensitive; R， Resistant.

2.6 組織病理損傷觀察

肝竇淤血，肝細胞索排列紊亂，肝細胞顆粒變性，細胞體積顯著增大，胞漿淡染，局部肝細胞空泡變性(圖4-A)；鰓小片上皮細胞壞死并脫落，鰓小片間有大量淡紅染的滲出物與炎癥細胞(圖4-B)；腸道黏膜上皮細胞壞死脫落，碎片散落于腸腔(圖4-C)，固有膜內(nèi)炎癥細胞浸潤；心肌纖維排列紊亂，橫紋消失，顆粒變性，甚至溶解壞死，肌間隙內(nèi)炎癥細胞浸潤(圖4-D)；脾臟明顯淤血、出血，黑色素巨噬細胞中心擴大，數(shù)量增多，淋巴細胞顯著減少，大量黃鐵血黃素沉著(圖4-E)；腎小管上皮細胞顆粒變性，甚至壞死，管腔內(nèi)見均質(zhì)紅染的蛋白或脫落的上皮細胞形成的管型，腎間質(zhì)大量淋巴細胞、巨噬細胞與中性白細胞浸潤(圖4-F)。

3 討論

假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌廣泛分布于土壤、淡水、海水中，其中的部分種類對水生動物的致病性逐步被發(fā)現(xiàn)，已有熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)感染錦鯉[16]、鱖[17]，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)感染河豚[18]，惡臭假單胞菌感染雜交鱘[8]、雜交鲇[9]、大黃魚[10, 19]以及三疣梭子蟹[5]等的報道，尤其是惡臭假單胞菌具有較為廣泛的感染宿主，已受到人們的高度關(guān)注。長薄鰍作為我國特有的瀕危物種，其保護與開發(fā)受到了社會的高度重視，相繼開展了馴化、人工繁殖與養(yǎng)殖等研究與實踐工作，但對于其疾病的研究還相當缺乏。本研究從患病長薄鰍體內(nèi)分離出菌株BMH170820，經(jīng)人工感染確定該分離菌的病原性，并通過16S rRNA和gyrB基因測序分析，結(jié)合菌落和細菌形態(tài)以及生理生化特性鑒定其為惡臭假單胞菌。由此可見，惡臭假單胞菌自然情況下也可感染長薄鰍致死亡，因此，在長薄鰍的養(yǎng)殖中應(yīng)重視該病的危害。

圖3 基于16S rRNA基因序列(A)與gyrB基因序列(B)構(gòu)建的菌株BMH170820與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic trees based on 16S rRNA (A) and gyrB gene (B) sequence of the isolated strain BMH170820 and other related species in Pseudomonas genus

據(jù)報道，歐洲鰻鱺[2]和羅氏沼蝦[6]感染時病變主要集中在鰓，表現(xiàn)為鰓絲潰爛；中華絨螯蟹[3]感染時主要表現(xiàn)為腳爪無力，容易脫落；而三疣梭子蟹[5]感染時表現(xiàn)為內(nèi)臟和肌肉組織溶解為乳白色的液體；以及黑鯛[7]和雜交鱘[8]主要表現(xiàn)為腸炎等。本研究中惡臭假單胞菌感染長薄鰍主要表現(xiàn)為體表潰瘍、出血，以及對肝、脾、腎，鰓和心等多組織器官的損傷?？梢?，惡臭假單胞菌感染不同的宿主可能具有不同的臨床特征與病理損傷特點，造成這種差異的原因是與宿主種屬特性有關(guān)，還是與菌株的差異有關(guān)值得進一步研究。此外，該菌對人體的感染率也呈上升趨勢，能引起葡萄球菌樣燙傷性皮膚綜合征[20]、敗血癥[21]、食物中毒[22-23]、傷口感染[24-25]等。因此，惡臭假單胞菌不僅對水產(chǎn)養(yǎng)殖危害嚴重，而且對人類健康也構(gòu)成威脅，應(yīng)給予高度重視。

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，惡臭假單胞菌的耐藥率也有上升的趨勢，耐藥菌株感染也越來越多，給治療帶來困難[26-27]。本研究中發(fā)現(xiàn)，從長薄鰍分離到的惡臭假單胞菌(BMH170820)對四環(huán)素、氧氟沙星、恩諾沙星以及強力霉素等10種抗生素敏感，對氟苯尼考、阿莫西林、頭孢氨芐、林可霉素等8種抗生素耐藥。這與楊圓圓等[8]報道雜交鱘源惡臭假單胞菌對氟苯尼考敏感；毛芝娟等[7]報道黑鯛源惡臭假單胞菌對氧氟沙星耐藥；Holmgaard等[28]報道人源惡臭假單胞菌對強力霉素耐藥的結(jié)果存在較大的差異。此外，Holmgaard等[28]還報道，從丹麥分離的人源惡臭假單胞菌具有包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類等6種耐藥基因，Peter等[29]也證實韓國分離的不同菌株間的耐藥基因存在差異，這表明不同菌株間存在耐藥性差異。因此，臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥物敏感性試驗結(jié)果選擇用藥，以避免藥物的濫用。另外，由于疾病發(fā)生除了病原因素之外，還與環(huán)境、機體等因素有關(guān)，因此，有必要開展惡臭假單胞菌感染相關(guān)的環(huán)境風險因素的研究，以明確不同環(huán)境因子在發(fā)病風險中的作用，為養(yǎng)殖過程通過環(huán)境調(diào)控降低該病的發(fā)生風險提供依據(jù)。人類醫(yī)學(xué)已發(fā)現(xiàn)，惡臭假單胞菌的感染往往與機體的免疫力低下相關(guān)，因此，在長薄鰍的養(yǎng)殖過程適時使用微生態(tài)制劑與免疫增強劑，改善正常菌群[30]，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，增強動物抵抗力[31]也可能是防控該菌感染的重要策略。

A，肝細胞顆粒變性，空泡變性；B，鰓小片上皮細胞壞死、脫落，炎癥細胞浸潤；C，腸黏膜上皮細胞壞死，脫落；D，心肌纖維變性，壞死，溶解；E，脾出血，淋巴細胞減少；F，腎小管上皮細胞變性，壞死，間質(zhì)炎癥細胞浸潤。A， Granular and vacuolar degeneration in hepatocytes; B， Epithelial necrosis and abscission of the lamellae along with infiltration of inflammatory cells; C， Epithelial necrosis and abscission in intestinal mucosa; D， Degeneration， necrosis and myolysis of myocardial fiber; E， Hemorrhage and lymphocytopenia in spleen; F， Degeneration and necrosis in renal tubular epithelia and inflammatory cell infiltration of renal interstitium.圖4 感染惡臭假單胞菌長薄鰍的組織病理學(xué)損傷(HE)Fig.4 Histopathological lesions of Leptobotia elongate infected by P. putida(HE)