劉江英，朱建津，*，蔣 蓉，劉子微

(1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122； 2.無錫三智生物科技有限公司，江蘇 無錫 214115)

沙門氏菌是一種常見的人畜共患病原菌，其傳播的主要媒介為家禽及其肉蛋類，并隨著食物鏈進入人體，給人類及畜禽養(yǎng)殖帶來巨大損失[1-2]。目前，主要應用藥物來控制和預防家禽沙門氏菌感染，隨著抗生素的濫用，沙門氏菌的耐藥性逐漸增強[3]，尋找新的預防沙門氏菌感染、增強動物防御能力的物質(zhì)迫在眉睫。已有研究表明，多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠提高動物腸道健康水平，飼料經(jīng)益生菌發(fā)酵后，含有的益生菌和代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFA)被證實能夠有效阻止革蘭氏陰性菌在腸道定植[4-5]。本試驗預先給肉雞飼喂發(fā)酵飼料，隨后進行沙門氏菌感染試驗，旨在研究多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對肉雞抗沙門氏菌感染能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

BioTek Epoch全波長酶標儀(美國BioTek公司)；7900HT Fast RT-PCR儀(美國ABI公司)；石蠟組織切片機(德國Leica公司)。

1.1.2 試劑

乳酸菌菌液(由植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌組成，菌落總數(shù)≥5×108CFU·mL-1)、芽孢桿菌和酵母菌混合菌粉(由地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌組成，芽孢桿菌菌落總數(shù)≥5×108CFU·g-1，釀酒酵母菌菌落總數(shù)≥5×107CFU·g-1)，無錫三智生物科技有限公司；酸性蛋白酶(酶活≥50 000 U·g-1)，杭州保安康生物技術(shù)有限公司；腸炎沙門氏菌24119，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；白細胞介素-1β(IL-1β)白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)及D-乳酸(D-LA)Elisa試劑盒，廈門慧嘉生物科技有限公司；RT-PCR相關(guān)試劑，美國Thermo Scientific公司；SYBR Green Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司；基因引物，上海睿迪生物科技有限公司。

1.1.3 試驗動物

1日齡中速黃羽肉雞(35.78±4.03)g 50只，購自麗水市綠園種雞場，經(jīng)動物衛(wèi)生監(jiān)督所檢驗合格。

1.2 試驗設計

1.2.1 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料的制備

使用密封袋進行小包飼料的簡易發(fā)酵。將發(fā)酵底物玉米、麩皮、豆粕經(jīng)粉碎，過40目篩，按4∶3∶3比例混合，取1 kg混合物加1 g芽孢桿菌和酵母菌混合菌粉、30 mL乳酸菌菌液、0.4 g酸性蛋白酶及經(jīng)暴曬后的自來水1 000 mL，混合均勻裝袋，擠壓排氣后置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，發(fā)酵9 d后取樣備用。

1.2.2 動物試驗

將50只1日齡中速黃羽肉雞隨機分為5個處理組，對照組、模型對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(基礎(chǔ)日糧+10%未發(fā)酵飼料)，抗生素對照組在基礎(chǔ)飼糧中添加20 mg·kg-1硫酸粘桿菌素，5%發(fā)酵組、10%發(fā)酵組分別用5%、10%發(fā)酵飼料替代基礎(chǔ)飼糧中的未發(fā)酵飼料。肉雞13日齡時，對照組連續(xù)2 d口腔灌服400 μL無菌水，其他組連續(xù)2 d口腔灌服400 μL沙門氏菌液(1×109CFU·mL-1)。肉雞15日齡時進行屠宰取樣。試驗肉雞以處理為單位進行圈養(yǎng)，采用群飼，自由采食和飲水，不接種疫苗?；A(chǔ)日糧配方見表1。

1.3 樣本采集

飼養(yǎng)結(jié)束時，頸靜脈取血，4 ℃放置30 min后離心，移取上層血清，分裝后保存于-80 ℃冰箱中待測。取結(jié)腸黏膜組織勻漿后，離心取上清液，分裝后保存于-80 ℃冰箱中。取2 cm左右肉雞結(jié)腸組織，用0.1 mol·L-1、pH 7.3的磷酸緩沖液洗凈內(nèi)容物后，放入4%甲醛固定液，4 ℃保存。刮取結(jié)腸黏膜組織0.1 g迅速浸入已放有Trizol的滅酶EP管中，勻漿后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標及方法

1.4.1 結(jié)腸形態(tài)

制作結(jié)腸組織切片，蘇木素伊紅(HE)染色后封片，用光學顯微鏡由低倍到高倍觀察。

1.4.2 血清炎癥因子、LPS、D-LA的測定

按照試劑盒說明書測定血清炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、血清LPS及D-LA水平。

1.4.3 結(jié)腸黏膜組織總RNA的提取

采用Trizol法提取結(jié)腸黏膜組織的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，參考文獻[6]進行RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.4.4 TLR4信號通路中關(guān)鍵信號分子

采用RT-PCR法測定TLR4信號通路的關(guān)鍵信號分子TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB的基因表達。反應體系為10 μL: SYBR Green Master Mix 5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 0.5 μL，DEPC水3.7 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。引物序列見表2。以β-actin為內(nèi)參，2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對沙門氏菌感染肉雞血清促炎性細胞因子水平的影響

如圖1所示，沙門氏菌感染顯著(P<0.05)提高了肉雞血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，飼糧中添加20 mg·kg-1硫酸粘桿菌素或發(fā)酵飼料，與模型對照組相比，血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)。飼糧中添加10%發(fā)酵飼料，肉雞血清中IL-1β水平顯著(P<0.05)低于添加5%發(fā)酵飼料組和抗生素組，IL-6、TNF-α水平與這2個處理差異(P>0.05)不顯著。飼糧中添加多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能有效降低血清中促炎因子水平，添加10%發(fā)酵飼料的改善效果與添加20 mg·kg-1硫酸粘桿菌素的效果接近。

表1基礎(chǔ)飼量組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

Table1Composition and nutrition level of basal diet(air-dry basis)

原料 Ingredients含量 Content/%營養(yǎng)水平 Nutrient levels含量Content2)玉米 Corn60.2代謝能Metabolism energy/(MJ·kg-1)12.13 魚粉 Fish meal2.0粗蛋白質(zhì) Crude protein/%20.00 干酒糟及其可溶物 DDGS2.0賴氨酸 Lys/%1.25豆粕 Soybean meal30.0蛋氨酸+胱氨酸 Met+Cys/%0.87豆油 Soybean1.5蘇氨酸 Thr/%0.83磷酸氫鈣 CaHPO41.5色氨酸 Trp/%0.26碳酸鈣 CaCO31.5鈣 Ca/%1.02食鹽 Salt0.3有效磷Virtual phosphorus/%0.45預混料 Premix1)1.0合計 Total100.0

1)預混料為每kg飼量提供Fe 66.5 mg(FeSO4·H2O)，Zn 88 mg(Zn SO4·7 H2O)，Mn 110 mg(MnSO4· H2O)，I 0.7 mg(CaI2)，Se 0.288 mg(Na2SeO3)，Cu: 8.8 mg(CuSO4·5H2O)，VA11 500 IU，VB13.38 mg，VB29 mg，VD33 500 IU，VE30 mg，VK35 mg，泛酸鈣 13 mg，VB68.96 mg，氯化膽堿 800 mg，VB120.025 mg，煙酸 45 mg，生物素 0.08 mg，葉酸 1.20 mg。2)以上均為計算值。

1)The premix provided the following for per kg of diets: Fe 66.5 mg(FeSO4·H2O)，Zn 88 mg(Zn SO4·7 H2O)，Mn 110 mg(MnSO4· H2O)，I 0.7 mg(CaI2)，Se 0.288 mg(Na2SeO3)，Cu: 8.8 mg(CuSO4·5H2O)，VA11 500 IU，VB13.38 mg，VB29 mg，VD33 500 IU，VE30 mg，VK35 mg，Calcium pantothenate 13 mg，VB68.96 mg，choline chloride 800 mg，VB120.025 mg，niacin 45 mg，biotin 0.08 mg，folic acid 1.20 mg. 2)These are all calculated values.

表2基因序列(16s rRNA)

Table2Sequences of primers (16s rRNA)

基因Gene正向引物 Forward primer(5’-3’)反向引物 Reverse primer(5’-3’)β-ActinGAGAAATTGTGCGTGACATCACCTGAACCTCTCATTGCCATLR4CTGACCTACCCATCGGACACGCCTGAGAGAGGTCAGGTTGMyD88TGATGCCTTCATCTGCTACTGTCCCTCCGACACCTTCTTTCTATRAF6GACTTGGATAGTGGCTGCTGTCCCTGCGTCTCCTCTGTGANF-κBCCAGGTTGCCATCGTGTTCCCGTGCGTTTGCGCTTCTC

2.2 TLR4信號通路關(guān)鍵信號分子的基因表達

如圖2所示，模型對照組的TLR4、MyB88、TRAF6、NF-κB mRNA相對表達量均較對照組顯著上升(P<0.05)?？股亟MMyD88、NF-κB mRNA表達顯著(P<0.05)低于模型對照組；5%發(fā)酵組和10%發(fā)酵組TLR4、MyB88mRNA表達量顯著(P<0.05)低于模型對照組和抗生素對照組。飼糧中添加多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠下調(diào)TLR4信號通路關(guān)鍵分子mRNA表達，且效果總體上優(yōu)于硫酸粘桿菌素。

2.3 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對沙門氏菌感染肉雞結(jié)腸形態(tài)的影響

如圖3所示，肉雞感染沙門氏菌后，結(jié)腸腸道絨毛排列稀疏，腫脹明顯，空泡數(shù)量較對照組明顯增多?？股睾投嗑N聯(lián)合發(fā)酵飼料可緩解沙門氏菌對結(jié)腸腸道形態(tài)的損傷。

2.4 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對沙門氏菌感染肉雞腸道屏障功能的影響

如圖4所示，肉雞感染沙門氏菌后，血清中LPS、D-LA水平顯著(P<0.05)上升，表明沙門氏菌的入侵導致肉雞腸道屏障功能受損。飼料中添加硫酸粘桿菌素、10%發(fā)酵飼料后，與模型對照組相比，LPS、D-LA水平顯著(P<0.05)降低。與模型對照組相比，添加5%發(fā)酵飼料可顯著(P<0.05)降低血清中LPS水平。

A，對照組；B，模型對照組；C抗生素對照組；D，5%發(fā)酵組；E，10%發(fā)酵組。柱上無相同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)，下同。A， control group；B， model control group；C， antibiotic control group；D， 5% fermented group；E， 10% fermented group. Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below.圖1 飼料對肉雞血清促炎性細胞因子水平的影響Fig.1 Influence of multi-strain co-fermented feed on the serum pro-inflammatory cytokines level of broilers

圖2 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對TLR4路徑信號分子mRNA表達的影響Fig.2 Influence of multi-strain co-fermented feed on mRNA expression of key signal molece of TLR4 pathway of broilers

A， 對照組；B，模型對照組；C抗生素對照組；D，5%發(fā)酵組；E，10%發(fā)酵組。A， control group；B， model control group；C， antibiotic control group；D， 5% fermented group；E， 10% fermented group.圖3 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對結(jié)腸形態(tài)的影響(200×)Fig.3 Influence multi-strain co-fermented feed on the colon morphology of broilers (200×)

圖4 多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料對肉雞腸道屏障功能的影響Fig.4 Influence of multi-strain co-fermented feed on serum LPS level of gut barrier functions of broilers

3 討論

腸道是動物體抵御致病菌入侵的重要防線[7]，沙門氏菌能夠通過炎癥反應與腸道菌群競爭，克服定植抵抗從而在腸道中大量繁殖并引發(fā)更嚴重的炎癥反應，直至破壞腸道屏障，引起全身疾病[8]。

本研究結(jié)果顯示，肉雞遭受沙門氏菌感染后，IL-6、TNF-α等促炎因子水平顯著上升，表明沙門氏菌的入侵引起了肉雞的炎癥反應。而炎癥反應的發(fā)生依賴于模式識別受體對病原保守分子的識別，TLR4可通過識別細性菌細胞壁中的LPS來介導腸上皮細胞產(chǎn)生免疫應答[9]。本研究結(jié)果表明，沙門氏菌的入侵導致TLR4路徑的關(guān)鍵信號分子mRNA表達量均顯著上升，提示TLR4在沙門氏菌誘導腸道炎癥的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用。

在本試驗中，飼喂多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料組肉雞腸道TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA相對表達量均顯著低于模型對照組，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著下降，提示多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠通過抑制沙門氏菌誘導的TLR4信號通路的激活，下調(diào)炎癥因子的釋放，以減輕沙門氏菌感染帶來的損傷，該結(jié)果與前人的研究結(jié)果相類似[10]。

腸道炎癥會破壞腸道屏障功能。血清LPS、D-LA是衡量腸黏膜功能是否完整的敏感性指標。當腸黏膜屏障功能正常時，LPS、D-LA均難以跨越腸黏膜屏障進入血液，一旦腸黏膜屏障功能遭到破壞，其在外周血中的含量將明顯升高。本研究結(jié)果顯示，沙門氏菌的入侵導致血清LPS、D-LA的含量顯著上升，表明沙門氏菌的入侵導致腸黏膜通透性增加，腸黏膜屏障功能遭受破壞，而多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠顯著降低血清LPS、D-LA含量，但效果略低于硫酸粘桿菌素，表明多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠減輕沙門氏菌入侵導致的腸道屏障功能受損的情況，該結(jié)果與結(jié)腸形態(tài)結(jié)果相對應，但究竟是益生菌起的作用還是代謝產(chǎn)物，亦或是兩者協(xié)同作用，還有待進一步研究。

綜上所述，多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料能夠通過抑制由沙門氏菌感染導致的TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB信號的激活，從而降低促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，減緩沙門氏菌感染導致的炎癥反應，此外其還能減輕沙門氏菌感染導致的腸道屏障受損。