王帥帥，張 才，2，*，孟素丹，黃永志，朱雪敏，王玉琴，2，楊自軍

(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物與科技學(xué)院，河南 洛陽 471000； 2.河南省肉羊繁育工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000)

我國(guó)奶牛的存欄量位于世界前列，奶牛圍產(chǎn)期的營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病日趨嚴(yán)重，脂肪肝病和酮病給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失。奶牛脂肪細(xì)胞是奶牛營(yíng)養(yǎng)代謝病研究的重點(diǎn)之一，成熟的脂肪細(xì)胞作為終末分化的細(xì)胞，體外分離比較困難，獲得率和存活率較低。通過分離奶牛脂肪干細(xì)胞，體外定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，可有效解決脂肪細(xì)胞體外分離的難題。已有國(guó)內(nèi)學(xué)者從荷斯坦牛中分離出前體脂肪細(xì)胞或原代脂肪細(xì)胞，并成功誘導(dǎo)分化成為脂肪細(xì)胞[10-11]，但并未對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

本研究采用組織剪碎法結(jié)合胰蛋白酶消化法消化、收集荷斯坦?fàn)倥ＤI周脂肪組織中的脂肪干細(xì)胞。通過體外培養(yǎng)、表面標(biāo)志物及生物學(xué)功能鑒定等方法對(duì)分離得到的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，以期為奶牛營(yíng)養(yǎng)代謝病的相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡健康荷斯坦雄性牛犢由生生牧業(yè)有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；速眠新購(gòu)自圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司；胰蛋白酶、膠原蛋白酶Ⅰ、二甲基亞砜(DMSO)、CCK8試劑盒、IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、吲哚美辛、 β-甘油磷酸鈉購(gòu)自北京Solarbio公司。鼠抗兔Vimentin、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90單克隆抗體，山羊抗兔IgG抗體，CY3顯色試劑盒，DAPI染液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；地塞米松、胰島素、維生素C(VC)購(gòu)自辰欣藥業(yè)有限公司。

1.2.2 主要儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡，德國(guó)Carl Zeiss AG公司；低溫高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；生物安全柜，上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司。

二是加強(qiáng)行業(yè)管理，建立以行業(yè)自律為主的會(huì)計(jì)職業(yè)道德管理機(jī)構(gòu)，對(duì)出具虛假會(huì)計(jì)信息的事務(wù)所予以重罰，直至取消其執(zhí)業(yè)資格，堅(jiān)決打擊違規(guī)者，凈化行業(yè)空氣，重塑行業(yè)信用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 犢牛脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

犢牛稱重，靜脈注射適量的速眠新，全麻后保定，對(duì)手術(shù)通路進(jìn)行剃毛、消毒等處理，在無菌條件下獲取腎周脂肪組織后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)。先用PBS清洗3次，在顯微鏡下仔細(xì)去除組織表面的血管、筋膜、結(jié)締組織等，剪成1 mm3的小塊。使用PBS沖洗3次后移入大離心管內(nèi)，加入0.25%的胰蛋白酶消化液37 ℃恒溫消化1 h，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，普通培養(yǎng)基(改良1640培養(yǎng)基+100 U·mL-1青霉素+0.1 mg·mL-1鏈霉素)重懸細(xì)胞再次離心，重復(fù)3次該操作。當(dāng)觀察到組織呈云霧狀或乳糜狀時(shí)，加入含血清培養(yǎng)基終止消化。以180目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾去除未消化組織，1 000 r·min-1離心10 min。PBS漂洗，離心去上清，加入完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的普通培養(yǎng)基)輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，備用。

1.3.2 犢牛脂肪干細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)

使用貼壁培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+5 μg·mL-1胰島素+0.5μg·mL-1地塞米松)調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104個(gè)·mL-1，接種5 mL細(xì)胞懸液于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放于CO2培養(yǎng)箱中(37 ℃、5% CO2、95%濕度)培養(yǎng)。24 h后首次換液，除去未貼壁細(xì)胞及雜質(zhì)，之后每3 d換液1次。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合達(dá)到80%～90%時(shí)，經(jīng)胰蛋白酶消化后，以1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.3 犢牛脂肪干細(xì)胞表面蛋白鑒定

取第5代細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至每孔1×104個(gè)，接種12孔板中(放入細(xì)胞爬片)，培養(yǎng)30 min后加入1.5 mL完全培養(yǎng)基，每3 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%時(shí)吸去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS清洗3次，加100 μL破膜工作液，室溫孵育10 min，PBS清洗3次，血清封閉30 min，加入大鼠抗兔Vimentin、CD31、CD34、CD44、CD45和CD90單克隆抗體，空白對(duì)照用PBS代替，平放于濕盒內(nèi)4 ℃過夜。次日取出，用PBS清洗3次，加入CY3標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，37 ℃避光孵育50 min，之后用PBS清洗3次，加入DAPI染液，避光室溫孵育10 min。細(xì)胞爬片稍微甩干后用抗熒光淬滅封片劑封固在載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 成脂誘導(dǎo)分化

取第10代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至每孔2×104個(gè)，接種于12孔板中。處理組和對(duì)照組各6孔，加入完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至70%時(shí)，處理組改用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+1 μmol·L-1地塞米松+10 μg·L-1胰島素+500 μmol·L-1IBMX+200 μmol·L-1吲哚美辛)培養(yǎng)，對(duì)照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2 d換液1次。培養(yǎng)21 d后，吸出培養(yǎng)基， PBS沖洗3次，室溫下加入4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS沖洗3次，加入油紅O染液，錫箔紙包被避光染色20 min，PBS沖洗3次，倒置顯微鏡下觀察。

1.3.5 成骨誘導(dǎo)分化

取第10代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至每孔2×104個(gè)，接種12孔板中。處理組和對(duì)照組各6孔，加入完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至70%時(shí)，處理組改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+50 mg·L-1VC+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+0.1 μmol·L-1地塞米松)培養(yǎng)，對(duì)照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2 d換液1次。培養(yǎng)21 d后，吸出培養(yǎng)基，用150 mmol·L-1NaCl沖洗3次， 4 ℃下用70%乙醇固定1 h，室溫下用2%茜素紅染色10 min，倒置顯微鏡下觀察。

1.3.6 細(xì)胞增殖情況

取第5代、第10代細(xì)胞，用胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104個(gè)·mL-1，接種于96孔板。以天數(shù)為單位分為8組，每組6個(gè)重復(fù)，其余6孔加入等量培養(yǎng)基作為對(duì)照組。接種24 h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定每24 h的吸光度值，連續(xù)測(cè)量7 d，制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

犢牛脂肪干細(xì)胞接種后24 h已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)呈梭狀逐漸展開，開始少量增殖(圖1-A)；48 h后細(xì)胞已經(jīng)伸展為梭形、多角形，細(xì)胞數(shù)量增多(圖1-B)；72 h后細(xì)胞大量增殖，呈鋪開生長(zhǎng)(圖1-C)；96 h后細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣，并且呈旋渦狀，細(xì)胞融合達(dá)到50%左右(圖1-D)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞融合度越來越高(圖1-E、1-F)。

A～F分別表示細(xì)胞接種后24 、48、72、96、120、144 h時(shí)的細(xì)胞形態(tài)。A-F represented morphology of adipose-derived stem cell which were cultured 24， 48， 72， 96， 120， 144 h.圖1 犢牛脂肪干細(xì)胞的形態(tài)Fig.1 Morphology of adipose-derived stem cells of calves

2.2 犢牛干細(xì)胞表面蛋白鑒定

由圖2可知，經(jīng)體外培養(yǎng)的第5代犢牛脂肪干細(xì)胞細(xì)胞核DAPI染色呈藍(lán)色；加入大鼠抗兔Vimentin、CD34、CD44、CD90單克隆抗體后， CY3染色呈紅色(圖A2、C2、D2、F2)，表明細(xì)胞Vimentin、CD34、CD44、CD90呈陽性表達(dá)；加入CD31、CD45單克隆抗體后，CY3未染色，表明細(xì)胞CD31、CD45呈陰性表達(dá)。

2.3 犢牛干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化

由圖3可以看出，細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)21 d后，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)椴灰?guī)則的多邊形、三角形，最后變?yōu)椴灰?guī)則的鈍圓形。細(xì)胞間及胞內(nèi)出現(xiàn)了折光率較強(qiáng)的類似于脂滴樣的物質(zhì)(圖3-C)，經(jīng)油紅O染色后，經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞被染成紅色(圖3-D)。未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)21 d后，細(xì)胞仍然呈長(zhǎng)梭形、旋渦狀生長(zhǎng)(圖3-A)，油紅O染色呈陰性(圖3-B)。

2.4 犢牛脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化

由圖4可以看出，細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)21 d后，細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞發(fā)生融合，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)明顯的骨化結(jié)(圖4-C)；茜素紅染色后，骨化結(jié)呈現(xiàn)暗紅色(圖4-D)。未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)21 d后，細(xì)胞沒有發(fā)生形態(tài)上的改變，也沒有堆積和產(chǎn)生骨結(jié)節(jié)(圖4-A)；茜素紅染色后，細(xì)胞未出現(xiàn)暗紅色的結(jié)節(jié)(圖4-B)。

2.5 犢牛脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

從圖5可以看出，第5代和第10代犢牛脂肪干細(xì)胞在第1天、第2天處于生長(zhǎng)潛伏期，第3天至第6天基本處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，第7天后基本處于生長(zhǎng)平臺(tái)期。這說明犢牛脂肪干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖比較穩(wěn)定，隨著細(xì)胞傳代的增加，生長(zhǎng)狀態(tài)基本無異常。

A1～F1為DAPI染色，A2～F2為CY3染色，A3～F3為DAPI復(fù)染CY3。A1-F1 represented DAPI staining， A2-F2 represented CY3 staining， A3-F3 represented DAPI redyeing CY3.圖2 犢牛脂肪干細(xì)胞免疫熒光染色Fig.2 Immunofluorescent staining results of the calf ADSCs

A、B，對(duì)照組染色前、后；C、D，處理組染色前、后。A and B represented cell morphology of control group before and after Oil Red O staining， C and D represented cell morphology of experimental group before and after Oil Red O staining.圖3 犢牛脂肪干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)染色結(jié)果Fig.3 Adipogenic induced staining results of the calf ADSCs

A、B，對(duì)照組染色前、后；C、D，處理組染色前、后。A and B represented cell morphology of control group before and after alizarin red staining， C and D represented cell morphology of experimental group before and after alizarin red staining.圖4 犢牛脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)染色結(jié)果Fig.4 Osteoginic induced staining results of the calf ADSCs

圖5 各代脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves of adipose-derived stem cells of different passages

3 討論

近些年對(duì)脂肪干細(xì)胞的研究主要集中在通過人體吸脂手術(shù)獲得脂肪干細(xì)胞來進(jìn)行體外培養(yǎng)和多向誘導(dǎo)分化，從而用于再生醫(yī)學(xué)和美容業(yè)[13-15]。動(dòng)物體脂肪干細(xì)胞研究主要集中在大鼠及兔等小動(dòng)物，用于肝損傷模型及骨折模型等研究[16-17]，關(guān)于奶牛等大型家畜脂肪干細(xì)胞的報(bào)道較少[18-19]。殷立恒[10]從荷斯坦?fàn)倥８骨淮缶W(wǎng)膜和腸系膜脂肪組織中分離培養(yǎng)得到1種脂肪前體細(xì)胞，誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，并檢測(cè)到脂肪前體細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞中成脂相關(guān)因子的表達(dá)。張世奇[11]從荷斯坦?fàn)倥８骨淮缶W(wǎng)膜和腸系膜脂肪組織中分離出原代脂肪細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染PLIN1過表達(dá)腺病毒和沉默siRNA，發(fā)現(xiàn)PLIN1可促進(jìn)甘油三酯在脂肪細(xì)胞的積累和脂滴的增多增大，同時(shí)可以抑制由NF-κB炎癥信號(hào)通路引起的炎癥反應(yīng)。本研究從奶牛腎周獲取脂肪組織，分離得到的脂肪干細(xì)胞與其他動(dòng)物不同部位分離所得的脂肪干細(xì)胞具有相似的細(xì)胞形態(tài)以及生長(zhǎng)特性。

脂肪干細(xì)胞表面的特異性蛋白尚無明確定論。2006年，國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)宣布脂肪干細(xì)胞的表型是CD31-/CD34+/CD45-[20-21]。2013年，國(guó)際脂肪應(yīng)用技術(shù)協(xié)會(huì)宣布新分離的脂肪干細(xì)胞表型為CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，而經(jīng)體外培養(yǎng)的ADSCs表型為CD31-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+[21-22]。本研究測(cè)定了犢牛脂肪干細(xì)胞Vimentin、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90 6個(gè)蛋白。CD34是目前學(xué)術(shù)界存在廣泛爭(zhēng)議的蛋白，陳猶白等[21]提出體內(nèi)的、剛分離的和體外培養(yǎng)初期的脂肪干細(xì)胞高表達(dá)CD34，但經(jīng)體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，其表達(dá)逐漸降低至最后完全消失。Vimentin是主要的中間絲蛋白之一，廣泛存在于各種間充質(zhì)細(xì)胞及中胚層來源的細(xì)胞中，本研究測(cè)得Vimentin染色呈陽性，說明分離所得的細(xì)胞是來源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞。而分離的細(xì)胞CD34、CD44、CD90呈陽性，CD31、CD45呈陰性，其表型基本符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)最新宣布的脂肪干細(xì)胞表型，可初步證明分離的細(xì)胞是犢牛脂肪干細(xì)胞。

脂肪干細(xì)胞的多向分化能力多可通過分化為成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞來鑒定，肖建紅等[23]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)第5代脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化后，經(jīng)油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)大量葡萄樣的紅色脂滴；張鑒清等[24]從小鼠附睪分離的脂肪干細(xì)胞經(jīng)體外成脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)可見較多圓形被染的小脂滴。李玲慧等[25]從大鼠腹腔內(nèi)取材，并對(duì)第3代脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成骨性誘導(dǎo)，28 d后經(jīng)茜素紅染色陽性，細(xì)胞堆積生長(zhǎng)，可見橘紅色深染的礦化結(jié)節(jié)。這與本研結(jié)果相似，證明試驗(yàn)分離的犢牛脂肪干細(xì)胞可以經(jīng)體外誘導(dǎo)定向分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。