彭成璐，張 瑜，夏曉冬，賀濛初，舒迎霜，馮士彬，李 玉，王希春，李錦春，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥230061)

大豆作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源，一直被廣泛應(yīng)用于畜禽飼糧[1]，大豆抗原蛋白是大豆中的主要致敏因子，依據(jù)蛋白質(zhì)沉降系數(shù)可將大豆抗原蛋白分為2S、7S、11S等。7S是大豆中最易引起過敏的蛋白質(zhì)[2-3]，占大豆籽實(shí)總蛋白的25%[4]，分子質(zhì)量為140～180 ku，是由α’-(76 ku)、α-(72 ku)和β-(52 ku)三種亞基組成的三聚體，其中，α-亞基是一種糖蛋白，分子質(zhì)量為57 ku，等電點(diǎn)為4.90，是大豆中主要的過敏原[5]。業(yè)已證實(shí)，豆粕發(fā)酵和大豆膨化等多種方法能使大豆制品的抗原活性低于生大豆[6-7]，但因大豆抗原蛋白熱穩(wěn)定性高，目前市面上的方法依然不能使之充分滅活。前期體內(nèi)試驗(yàn)得出，提前免疫7S或11S對(duì)仔豬有一定的免疫保護(hù)作用[8]。7S主要引起仔豬、犢牛等幼齡動(dòng)物，特別是斷奶仔豬的過敏反應(yīng)，主要表現(xiàn)為免疫功能紊亂和腸道損傷[9]。根據(jù)動(dòng)物腸道吸收蛋白的規(guī)律，7S在小腸中含量最高[10]。腸道是機(jī)體與外界環(huán)境接觸最為密切的部位，不僅是消化、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所，也是機(jī)體的重要免疫屏障[11]。位于腸道第一層的腸上皮細(xì)胞，對(duì)隔離外界環(huán)境起著重要作用，IPEC-J2細(xì)胞是小腸的功能細(xì)胞，此細(xì)胞系來源于仔豬空腸上皮細(xì)胞，Schierack等[12]通過電子顯微鏡分析、組織化學(xué)染色及細(xì)菌感染等多種方法得出IPEC-J2是非轉(zhuǎn)化的非致瘤性腸上皮細(xì)胞系，具有與體內(nèi)活性相當(dāng)?shù)姆只卣?，適合用于體外模型。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)道路參與調(diào)節(jié)腸道的炎癥、凋亡等病理機(jī)制[13]。細(xì)胞凋亡的眾多途徑最終都匯聚到Caspase-3的激活[14]，Bcl-2家族在線粒體調(diào)控的凋亡途徑中發(fā)揮重要作用，其主要包括促凋亡因子(Bax、Bak、Bad等)和抑制凋亡因子(Bcl-2等)[15]。

本研究構(gòu)建小腸上皮細(xì)胞模型，通過ELISA、PCR和Western blot等方法在細(xì)胞及分子水平上研究不同濃度7S及p38和JNK抑制劑對(duì)仔豬腸上皮細(xì)胞存活率以及相關(guān)炎性因子、蛋白和mRNA表達(dá)量的影響，為探索β-伴大豆球蛋白引發(fā)仔豬腸道黏膜過敏損傷的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

7S由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院提供(專利號(hào)：200，410，029，589.4，中國(guó))，再由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院進(jìn)一步提純(7S純度為91.3%)。IPEC-J2細(xì)胞購(gòu)自武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自biosharp，β-actin抗體購(gòu)自北京銳抗生物科技有限公司，羊抗兔和羊抗鼠二抗購(gòu)自biosharp，p-JNK抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司，p-p38抗體購(gòu)自博士德生物工程有限公司，Bcl-2抗體購(gòu)自proteintech，JNK抑制劑(SP600125)和P38抑制劑(SB202190)購(gòu)自MEC，IL-6、NO、5-HT、IL-10 ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇酶標(biāo)生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

采用隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IPEC-J2細(xì)胞，以1×105CFU·mL-1的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。置于37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，分為6組：A(對(duì)照組)、B(1 mg·mL-17S)、C(5 mg·mL-17S)、D(10 mg·mL-17S)、E(5 mg·mL-17S+1 μmol·L-1SP600125)、F(5 mg·mL-17S+1 μmol·L-1SB202190)，每個(gè)濃度組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 濃度摸索

在各組細(xì)胞中添加不同濃度的7S，后向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)明顯的顏色反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450 nm下讀取D值，計(jì)算細(xì)胞存活率。在各組細(xì)胞中加入5 mg·mL-17S和不同抑制劑，培養(yǎng)12、24和48 h，計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

添加不同濃度的7S和抑制劑后將IPEC-J2細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后再向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)明顯的顏色反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450 nm下讀取D值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 ELISA法檢測(cè)IPEC-J2細(xì)胞NO、IL-6、5-HT和IL-10的含量

收集IPEC-J2細(xì)胞，1 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心5 min，用PBS洗滌3次。之后向每個(gè)樣品中加入500 μL含0.1% Triton X-100的0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)，將樣品放入冰水中進(jìn)行超聲裂解。將細(xì)胞裂解液以l 000 r·min-1離心l0 min，收取上清液，按照ELISA試劑盒說明書中詳細(xì)操作步驟進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算NO、IL-6、5-HT和IL-10的含量。

1.6 Western blot法檢測(cè)p-JNK、p-p38、Bcl-2蛋白表達(dá)量

棄去廢液，收集細(xì)胞沉淀，加入混有蛋白酶抑制劑以及蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，

充分裂解之后14 000g離心10 min，收集上清液。將提取的蛋白質(zhì)樣品煮沸5 min，在SDS-PAGE凝膠中電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用含有0.05%Tween-20和5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST在室溫下封閉膜4 h，然后用一抗在4 ℃孵育過夜。將膜洗滌3次，并放入二抗在室溫下振蕩孵育45 min，洗膜后放入凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)中成像。

1.7 qPCR法檢測(cè)Bad、Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

目的基因及β-actin內(nèi)參引物序列參照GenBank，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及參數(shù)見表1。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 7S及抑制劑對(duì)IPEC-J2細(xì)胞存活率的影響

由圖1可知，1、5、10 mg·mL-17S對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的作用效果極顯著，添加15 mg·mL-17S時(shí)，細(xì)胞存活率過低。由圖2可知，添加抑制劑培養(yǎng)24 h時(shí)對(duì)7S致敏作用的抑制效果最好。由圖3可知，IPEC-J2細(xì)胞的存活率隨著7S濃度的增加而降低，與A組相比，B組細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異(P>0.05)，C、D組細(xì)胞存活率極顯著降低(P<0.01)；與C組相比，E、F組細(xì)胞存活率顯著增加(P<0.05)。

表1基因引物參數(shù)

Table1Primer parameters of the genes

基因Gene登錄號(hào)Accession number引物Primer序列Sequences (5′→3′)產(chǎn)物Product/bpBadXM_021082883.1ForwardGCCGAGATTAACCCTAACGC98ReverseCACACACGCGGGCTTTATTABaxXM_003127290ForwardCCGAAATGTTTGCTGACG154ReverseAGCCGATCTCGAAGGAAGTBcl-2NM_214285ForwardACCTGAATGACCACCTAGAGC180ReverseTCCGACTGAAGAGCGAACBcl-xlNM_214285.1ForwardTATTGGTGAGTCGGATCGCA127ReverseCTCTCAGCTGCTGCATTGTTCaspase-3NM_214131ForwardGTGGGACTGAAGATGACA190ReverseACCCGAGTAAGAATGTGactin414396ForwardCTGGACTTCGAGCAGGAGATGG168ReverseTTCGTGGATGCCGCAGGATTC

**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。** showed significant difference compared with the control group (P<0.01).圖1 不同濃度7S對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of 7S on the activity of IPEC-J2 cells

圖2 抑制劑作用不同時(shí)間對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effects of inhibitors on the activity of IPEC-J2 cells at different time

A，對(duì)照；B，1 mg·mL-1 7S；C，5 mg·mL-1 7S；D，10 mg·mL-1 7S；E，5 mg·mL-1 7S+1 μmol·L-1 SP600125；F，5 mg·mL-1 7S+1 μmol·L-1 SB202190。**表示與A組相比差異極顯著(P<0.01)；#表示與C組相比差異顯著(P<0.05)。下同。A， Control group; B， 1 mg·mL-1 7S; C， 5 mg·mL-1 7S; D， 10 mg·mL-1 7S; E， 5 mg·mL-1 7S+1 μmol·L-1 SP600125; F， 5 mg·mL-1 7S+1 μmol·L-1 SB202190.** showed significant difference compared with group A (P<0.01);# showed significant difference compared with group C (P<0.05). The same as below.圖3 IPEC-J2細(xì)胞活性Fig.3 IPEC-J2 cell activity

2.2 7S對(duì)IPEC-J2細(xì)胞NO、5-HT、IL-6和IL-10含量的影響

由圖4-a可知，與A組相比，B組細(xì)胞NO含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，C、D組細(xì)胞NO含量極顯著增加(P<0.01)。與C組相比，E、F組細(xì)胞NO含量顯著降低(P<0.05)。由圖4-b可知，與A組相比，B組細(xì)胞5-HT含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，C、D組細(xì)胞5-HT含量極顯著增加(P<0.01)。與C組相比，E、F組細(xì)胞5-HT含量顯著降低(P<0.05)。由圖4-c可知，與A組相比，B組細(xì)胞IL-6含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，C、D組細(xì)胞IL-6含量極顯著增加(P<0.01)。與C組相比，E、F組細(xì)胞IL-6含量顯著降低(P<0.05)。由圖4-d可知，與A組相比，B組細(xì)胞IL-10含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，C、D組細(xì)胞IL-10含量極顯著降低(P<0.01)。與C組相比，E、F組細(xì)胞IL-10含量顯著增高(P<0.05)。

2.3 7S對(duì)IPEC-J2細(xì)胞p-JNK、p-p38和Bcl-2蛋白表達(dá)量的影響

由圖5-b可見，與A組相比，B組細(xì)胞p-JNK蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，C、D組細(xì)胞p-JNK蛋白表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)，與C組相比，E、F組細(xì)胞p-JNK蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。由圖5-c可見，與A組相比，B組細(xì)胞p-p38蛋白表達(dá)量顯著增高(P<0.05)，C、D組細(xì)胞p-p38蛋白表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)，與C組相比，E、F組細(xì)胞p-p38蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。由圖5-d可見，與A組相比，B組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，C、D組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，與C組相比，E組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著增高(P<0.05)，F(xiàn)組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量極顯著增高(P<0.01)。

圖4 7S對(duì)IPEC-J2細(xì)胞NO、5-HT、IL-6和IL-10含量的影響Fig.4 Effect of 7S on NO， 5-HT， IL-6 and IL-10 contents in IPEC-J2

##表示與C組相比差異極顯著(P<0.01)。## showed significant difference compared with group C (P<0.01)圖5 7S對(duì)p-JNK、p-p38和Bcl-2蛋白表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of 7S on the expression of p-JNK， p-p38 and Bcl-2 proteins

2.4 7S對(duì)Bcl-2/Bax比值、Bax/Bcl-xl比值、Bad mRNA和Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖6-a可知，與A組相比，B組細(xì)胞Bcl-2/Bax比值無(wú)顯著差異(P>0.05)，C、D組細(xì)胞極顯著降低(P<0.01)。與C組相比，E、F組細(xì)胞Bcl-2/Bax比值極顯著增高(P<0.01)。由圖6-b可知，與A組相比，B組細(xì)胞Bax/Bcl-xl比值無(wú)顯著差異(P>0.05)，C、D組細(xì)胞Bax/Bcl-xl比值極顯著增高(P<0.01)。與C組相比，E、F組細(xì)胞Bax/Bcl-xl比值極顯著降低(P<0.01)。由圖6-c可知，與A組相比，B組細(xì)胞BadmRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，C、D組細(xì)胞BadmRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著增高(P<0.01)。與C組相比，E組細(xì)胞BadmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)組細(xì)胞BadmRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。由圖6-d可知，與A組相比，B組Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，C、D組Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著增高(P<0.01)。與C組相比，E、F組Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

圖6 7S對(duì)Bcl-2/BAX、BAX/Bcl-xL、Bad mRNA和caspase-3 mRNA的影響Fig.6 Effect of 7S on the relative expression of Bcl-2/BAX， BAX/Bcl-xL， Bad mRNA and caspase-3 mRNA

3 討論

Chen等[16]評(píng)估了不同濃度β-伴大豆球蛋白(0～1 500 μg·mL-1)和培養(yǎng)時(shí)間(48或72 h)對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)組的影響，發(fā)現(xiàn)β-伴大豆球蛋白通過抑制腸細(xì)胞生長(zhǎng)直接誘導(dǎo)腸損傷，破壞細(xì)胞骨架并導(dǎo)致仔豬腸道細(xì)胞凋亡。Zhao等[17]使用IPEC-J2模型評(píng)估β-伴大豆球蛋白誘導(dǎo)的上皮滲透性，完整性，代謝活性，緊密連接(TJ)分布和表達(dá)的變化，7S能抑制腸上皮細(xì)胞增殖和促進(jìn)腸上皮細(xì)胞凋亡。隨著7S的增加，發(fā)現(xiàn)緊密連接occludin和ZO-1 mRNA表達(dá)線性下降。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IPEC-J2細(xì)胞的存活率隨著7S濃度的增加而降低，并且與同濃度7S(5 mg·mL-1)而未添加抑制劑的細(xì)胞相比，添加JNK/P38抑制劑可以減弱7S對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的損傷作用。

Wu等[18-19]通過給斷奶仔豬飼喂7S，發(fā)現(xiàn)7S誘導(dǎo)過敏反應(yīng)，損傷腸黏膜，增加腸道通透性和促進(jìn)斷奶仔豬的sIgA合成，增加仔豬血清IL-6和5-HT等炎性因子水平，引起仔豬體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明7S促進(jìn)IPEC-J2分泌IL-6、5-HT、NO等炎性因子。與添加5 mg·mL-17S的細(xì)胞相比，添加5 mg·mL-17S和1 μmol·L-1p38或JNK抑制劑組的豬小腸上皮細(xì)胞分泌IL-6、NO和5-HT量均受到抑制，欒兆雙等[13]通過腹腔注射p38和JNK抑制劑發(fā)現(xiàn)在斷奶應(yīng)激致仔豬小腸黏膜屏障受損過程中，抑制p38和JNK通路后，腸屏障得到改善，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，劉欣[20]通過用11S和7S灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)11S和7S使小鼠小腸組織中IL-10 mRNA的表達(dá)量降低，與本實(shí)驗(yàn)ELISA結(jié)果相符合。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7S可以促進(jìn)p-p38和p-JNK蛋白的磷酸化，與添加5 mg·mL-17S的細(xì)胞相比，添加5 mg·mL-17S和1 μmol·L-1p38或JNK抑制劑后，p-p38 MAPK和p-JNK蛋白表達(dá)量降低，說明7S通過p38/JNK MAPK信號(hào)通路引起仔豬小腸上皮細(xì)胞損傷，并且p38和JNK抑制劑可以降低小腸上皮細(xì)胞過敏反應(yīng)。

Markou等[21]通過成人心機(jī)細(xì)胞模型驗(yàn)證JNK和p-38信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制p38-MAPK導(dǎo)致Bcl-2磷酸化水平降低。Bcl-2和Bax表達(dá)的高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān)，Bcl-2與Bax比率決定細(xì)胞在受刺激后是啟動(dòng)抑制凋亡機(jī)制還是促凋亡機(jī)制[15，22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Bcl-2/Bax比值隨7S濃度增加而降低，說明7S刺激豬腸上皮細(xì)胞細(xì)胞啟動(dòng)促凋亡機(jī)制。已知Bad通過與Bax和Bcl-2形成異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[23]，本實(shí)驗(yàn)中，隨著7S濃度增加，BadmRNA相對(duì)表達(dá)量增加，說明7S刺激豬腸上皮細(xì)胞凋亡。Bax/Bcl-xl比值的增高使Bax可以通過內(nèi)在的細(xì)胞凋亡途徑發(fā)出凋亡信號(hào)，觸發(fā)線粒體孔隙向細(xì)胞質(zhì)釋放促凋亡因子Bax，導(dǎo)致Caspase-3激活[24]。本實(shí)驗(yàn)中Bax/Bcl-xl比值隨7S濃度增加而升高，Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量隨7S濃度增加而升高，表明7S激活了細(xì)胞凋亡的線粒體和死亡受體凋亡途徑，添加5 mg·mL-17S和1 μmol·L-1p38或JNK抑制劑的細(xì)胞，與添加5 mg·mL-17S的細(xì)胞相比Caspase-3、BadmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，Bcl-2/Bax比值增高，Bax/Bcl-xl比值降低。說明7S通過p38/JNK MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)豬腸細(xì)胞凋亡，p38或JNK抑制劑可以抑制7S誘導(dǎo)的豬腸上皮細(xì)胞凋亡。