張克賢，孫勇民，黃艷玲，張軼斌

(天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院 天津300350)

光電二極管陣列檢測(cè)器是高效液相色譜近年來發(fā)展的新技術(shù)，它的開發(fā)和應(yīng)用使得高效液相色譜技術(shù)不僅能夠進(jìn)行分離定量，而且具備光譜掃描、波長(zhǎng)選擇、獲得色譜和光譜的三維譜圖、定性以及色譜峰純度判斷等功能。

光電二極管陣列檢測(cè)器的工作原理是用一組光電二極管同時(shí)檢測(cè)透過樣品的所有波長(zhǎng)紫外光和可見光，與普通的紫外檢測(cè)器不同的是，進(jìn)入流動(dòng)池的光不再是單色光。光源經(jīng)一系列光學(xué)反射鏡進(jìn)入流動(dòng)池，從流動(dòng)池出來的光再經(jīng)分光系統(tǒng)、狹縫照射到二極管陣列裝置上，數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)實(shí)時(shí)記錄下組分的光譜吸收，從而獲得特定組分的結(jié)構(gòu)信息，得到色譜保留時(shí)間、光譜波長(zhǎng)和峰強(qiáng)度值的三維的立體譜圖。因此，在結(jié)果中既可以察看各波長(zhǎng)下的色譜圖又可以察看各保留時(shí)間下的光譜圖。光電二極管陣列檢測(cè)器-高效液相色譜技術(shù)在食品、藥品和農(nóng)藥殘留等分析中應(yīng)用廣泛，如：利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法分析飲料和蜜柚中維生素C 和光譜定性，測(cè)定食品添加劑苯甲酸含量，檢測(cè)柑橘果汁中12 種多甲氧基黃酮、類黃酮物質(zhì)等。

本文用光電二極管陣列檢測(cè)器-高效液相色譜儀分析純桔汁的類黃酮成分并定性和定量，利用光電二極管陣列檢測(cè)器技術(shù)，對(duì)純桔汁進(jìn)行光譜掃描、波長(zhǎng)選擇，獲得色譜和光譜的三維譜圖并進(jìn)行色譜峰純度判斷，定性類黃酮中的橙皮苷并以純桔汁的橙皮苷為基準(zhǔn)峰定量規(guī)定含桔汁飲料的桔汁含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

LC-20AD 型島津高效液相色譜儀，帶有Prominence SPD-M20A 型二極管陣列檢測(cè)器，SIL-20A 型自動(dòng)進(jìn)樣器，Prominence LC-20AD 型泵2 臺(tái)，CTO-20A 型柱溫箱，島津技邇(上海)商貿(mào)公司W(wǎng)ondaSil C18 Superb(250 mm×4.6 mm，5 μm)反相色譜柱和LabSolutions Essentia 工作站。濟(jì)南清川儀器有限有公司流動(dòng)相過濾裝置(QC-01 型真空泵和玻璃濾瓶一套)，0.22 μm 水型和溶劑型濾膜。江蘇省昆山市超生儀器有限公司KQ-100VDV 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器。針筒式濾膜過濾器[0.22 μm(水系)和0.22 μm(有機(jī)系)]和5～10 mL 注射器。德國(guó)艾本德公司5804R 型高速離心機(jī)。

島津SPD-M20A 具有512 個(gè)光電二極管，光源為氘燈+鎢燈，光譜帶寬為1.2 nm(高分辨方式，8 nm高靈敏度方式)，波長(zhǎng)準(zhǔn)確度為±1 nm，波長(zhǎng)精密度為±0.1 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍190～800 nm。通過PDA數(shù)據(jù)可以建立一次進(jìn)樣純化中適合多個(gè)不同吸收特性的樣品制備分離方法。

1.2 試劑和材料

橙皮苷(純度96.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，乙腈(HPLC 色譜純，天津市起連興化學(xué)品有限公司)，冰乙酸(HPLC 色譜純，天津市起連興化學(xué)品有限公司)，甲醇(HPLC 色譜純，天津市起連興化學(xué)品有限公司)，純鮮榨桔汁(天津山海關(guān)飲料有限公司提供)，實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)過Milli-Q Adwantage A10 型超純水機(jī)過濾后的超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

利用同一批次純鮮榨桔汁由天津山海關(guān)飲料有限公司制備濃度為3%、5%、7%、10%、20%的碳酸型桔汁飲料，然后將該純鮮榨桔汁用超純水配成10%～80%樣品(純鮮榨桔汁配制前振蕩、搖勻，保證桔汁均勻一致再進(jìn)行配制)，分別移取上述樣品25 mL 于50 mL 容量瓶中用乙腈定容成50 mL，同樣配制純鮮榨桔汁。將樣品和溶劑配伍后經(jīng)超聲脫氣，再分別移取6～7 mL 于10 mL 離心試管中，離心5 min 后取上層清液，經(jīng)0.22 μm 針筒式濾膜過濾器過濾，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用精度0.1 mg 的電子天平稱取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品0.025 6 g置于50.00 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容。如果溶解中較困難需用超聲波進(jìn)行超聲溶解后再定容。該定容物為500 mg/L 的新橙皮苷儲(chǔ)備液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線需要逐級(jí)稀釋成不同濃度的使用液。

1.3.3 儀器條件確定

優(yōu)化后的色譜條件為：以島津技邇(上海)商貿(mào)公司W(wǎng)ondaSil C18 Superb(250 mm×4.6 mm，5 μm)反相色譜柱為分析柱，0.2%乙酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣30 μL，梯度洗脫(洗脫程序見表1)，柱溫40 ℃，DAD 檢測(cè)器在190～800 nm 檢測(cè)橙皮苷化合物。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure for mobile phase

1.3.4 純鮮榨桔汁和橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的三維譜圖

將樣品制備純鮮榨桔汁和橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)備液按照流動(dòng)相梯度洗脫程序進(jìn)行二極管陣列檢測(cè)器-高效液相色譜分析，通過3D 視圖得到它們的色譜保留時(shí)間、光譜波長(zhǎng)和峰強(qiáng)度值的三維立體譜圖(見圖1 和圖2)。二極管陣列檢測(cè)器-高效液相色譜可以提供全波長(zhǎng)的色譜圖，包括單波長(zhǎng)色譜圖、任意2 個(gè)波長(zhǎng)的吸收比色譜圖、波長(zhǎng)時(shí)間程序色譜圖、最大吸收波長(zhǎng)色譜圖以及總體吸收色譜圖，其中最大吸收波長(zhǎng)色譜圖為靈敏度最高的檢測(cè)方式，而總體吸收色譜圖為定量重復(fù)性最好的方法。

圖1 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜、光譜三維譜圖Fig.1 Chromatogram and three-dimensional spectrum of hesperidin standard

圖2 純鮮榨桔汁的色譜、光譜三維譜圖Fig.2 Chromatogram and three-dimensional spectrum of pure fresh orange juice

1.3.5 純鮮榨桔汁和橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

將純鮮榨桔汁和橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)備液按照流動(dòng)相梯度洗脫程序進(jìn)行二極管陣列檢測(cè)器-高效液相色譜分析，同時(shí)得到的色譜圖在波長(zhǎng)190～800 nm 范圍任一波長(zhǎng)條件下均進(jìn)行了色譜數(shù)據(jù)采集，當(dāng)需要某一波長(zhǎng)色譜圖時(shí)，輸入波長(zhǎng)即可顯示該波長(zhǎng)條件下的色譜圖。圖3 和圖4 為某波長(zhǎng)的色譜圖。

圖3 某一波長(zhǎng)的純鮮榨桔汁的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of pure fresh orange juice at a wavelenth

圖4 某一波長(zhǎng)的橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of hesperidin standard at a wavelength

1.3.6 純鮮榨桔汁和橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的光譜視圖

二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行數(shù)據(jù)采集時(shí)，采集色譜分離鋒的同時(shí)進(jìn)行光譜波長(zhǎng)190～800 nm 范圍的掃描并記錄數(shù)據(jù)，獲得光譜視圖見圖5 和圖6(圖5 為橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品光譜視圖，圖6 為純鮮榨桔汁中橙皮苷峰的光譜視圖)。因?yàn)轭慄S酮在紫外波長(zhǎng)范圍有吸收，而可見光部分沒有吸收，所以截取光譜視圖波長(zhǎng)區(qū)間為190～400 nm。

圖5 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品光譜視圖Fig.5 Spectroscopic view of hesperidin standard

圖6 純鮮榨桔汁中橙皮苷峰的光譜視圖Fig.6 Spectroscopic view of hesperidin in pure fresh orange juice

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)樣橙皮苷波長(zhǎng)的選擇

普通紫外檢測(cè)器液相條件的波長(zhǎng)選擇通過紫外分光光度計(jì)掃描選擇最大吸收波長(zhǎng)后，將該吸收波長(zhǎng)設(shè)定紫外檢測(cè)器進(jìn)行HPLC 分析測(cè)試，其中的缺陷是這個(gè)最大吸收波長(zhǎng)為混合組分的最大吸收波長(zhǎng)，而二極管陣列檢測(cè)器液相可以分別對(duì)各個(gè)峰或各個(gè)組分進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)的選擇。例如圖5 和圖6：圖5為橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品光譜視圖，圖6 為純鮮榨桔汁中橙皮苷峰的光譜視圖，其最大吸收波長(zhǎng)均為283 nm。選擇最大吸收波長(zhǎng)達(dá)到可以進(jìn)行靈敏度最高的檢測(cè)，因此二極管陣列檢測(cè)器-高效液相色譜不僅包括了所有紫外檢測(cè)器液相色譜儀的功能，還可完全代替紫外檢測(cè)器進(jìn)行HPLC 分析。

另外，通過記錄不同吸收波長(zhǎng)色譜圖并平鋪?zhàn)V圖，記錄選定峰的強(qiáng)度值與吸收波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)便可以得到該峰的最大吸收波長(zhǎng)，見圖7、表2 和圖8。圖7 為不同吸收波長(zhǎng)色譜圖并多譜圖排列，顯示保留時(shí)間、波長(zhǎng)和峰的強(qiáng)度值等信息；表2 記錄波長(zhǎng)與峰強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)數(shù)值；圖8 為波長(zhǎng)與峰強(qiáng)度值散點(diǎn)示意圖。

圖7 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品不同波長(zhǎng)的色譜圖Fig.7 Chromatogram of hesperidin standard at different wavelengths

表2 不同波長(zhǎng)檢測(cè)出色譜圖對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度值Tab.2 Different wavelengths to detect the corresponding intensity values of excellent spectra

圖8 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品波長(zhǎng)與峰強(qiáng)度值散點(diǎn)示意圖Fig.8 Sketch map of dispersion of hesperidin standard wavelength and peak intensity

2.2 鮮榨桔汁中橙皮苷成分定性

將經(jīng)過離心、超聲脫氣和過濾好的鮮榨桔汁和乙腈混合物(體積比為1∶1)，轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，同樣制備新橙皮苷儲(chǔ)備液轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，按照上述色譜條件進(jìn)行色譜分析。桔汁中橙皮苷定性采用保留時(shí)間和樣品中加入橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)物后某一峰增高的方法完成，見圖3、圖4 和圖9。圖3鮮榨桔汁與圖 4 中橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間約17.7 min 相對(duì)應(yīng)；圖9 中加入橙皮苷內(nèi)標(biāo)物該峰明顯增高，說明該峰為樣品中橙皮苷成分。

圖9 鮮榨桔汁加入橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.9 Chromatogram of standard orange juice added hesperidin standard

2.3 鮮榨桔汁中橙皮苷色譜峰純度判斷

紫外檢測(cè)器液相不能進(jìn)行色譜峰純度判斷，而二極管陣列檢測(cè)器液相可以進(jìn)行色譜峰純度判斷，見圖10 和圖11。純度視圖中峰純度閾值達(dá)到該峰純度要求，不受噪音影響，峰輪廓圖也無噪音影響。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將橙皮苷儲(chǔ)備液進(jìn)行不同濃度梯度稀釋，配制5、10、15、20 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)使用液并進(jìn)行過濾，在相同儀器條件下進(jìn)行色譜分析，以橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以濃度對(duì)應(yīng)峰面曲積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖12)，得到回歸方程：y＝32 473x，回歸系數(shù)為0.998 2。未知樣經(jīng)過色譜分析，通過峰面積利用該標(biāo)準(zhǔn)線即可求出濃度。

圖10 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的峰純度圖Fig.10 Peak purity map of hesperidin standard

圖11 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的峰輪廓圖Fig.11 Peak profile of hesperidin standard

圖12 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.12 Standard curve of hesperidin

2.5 桔汁含量計(jì)算

原桔汁純品在相同儀器條件下進(jìn)行色譜分析，得到原果汁純品的橙皮苷HPLC 峰面積，記為S純，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出原果汁中的橙皮苷含量C純。利用同一批次原果汁純品配制的不同濃度的桔汁樣品，進(jìn)行相同條件分析，分別得到各個(gè)不同濃度桔汁樣品的HPLC 峰面積，同樣分別計(jì)算橙皮苷濃度。

以稀釋樣橙皮苷濃度除以純樣橙皮苷濃度得到配制橙汁含量，計(jì)算公式如下：

式中：Xi為桔汁含量，%；Pi為稀橙皮苷含量，mg/L；P純?yōu)榧儤有鲁绕ぼ蘸?，mg/L；Si為稀釋樣新橙皮苷HPLC 峰面積；Si純?yōu)榧儤映绕ぼ誋PLC 峰面積(當(dāng)測(cè)定中使用同一橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)可以簡(jiǎn)化算式用橙皮苷HPLC 峰面積直接計(jì)算)。

2.6 不同含量桔汁及桔汁飲料測(cè)定結(jié)果及其與國(guó)標(biāo)法對(duì)比

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 12143—2008 方法，檢測(cè)了天津山海關(guān)飲料有限公司制備的濃度為3%、5%、7%、10%、20%的碳酸型桔汁飲料和該純鮮榨桔汁用超純水配成的10%～80%樣品中可溶性固形物、鉀、總磷、氨基酸態(tài)氮、L-脯氨酸、總D-異檸檬酸和總黃酮7 項(xiàng)指標(biāo)，并依據(jù)后6 種組分的標(biāo)準(zhǔn)值和權(quán)值綜合計(jì)算桔汁添加量，同時(shí)用二極管陣列檢測(cè)器液相色譜法檢測(cè)了上述樣品的桔汁含量，并與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。最終確定以橙皮苷作為快速檢測(cè)的基準(zhǔn)物，相對(duì)誤差控制在1%范圍內(nèi)，空白加標(biāo)回收率在98%～103%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1%～3%之間，相對(duì)誤差在1%～5%之間(表3)。國(guó)標(biāo)法在相對(duì)誤差3%～8%之間(表4)。

表3 不同濃度的桔汁樣品測(cè)定回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Test results of recovery rate of orange juice samples with different concentrations

表4 國(guó)標(biāo)方法與本方法檢測(cè)桔汁含量比較Tab.4 Comparison of national standard method and this method for orange juice content determination

3 結(jié) 論

光電二極管陣列檢測(cè)器高效液相色譜法具有溶劑使用量少、凈化效果好、操作簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，可用于純鮮榨桔汁及其制品的桔汁含量的測(cè)定；與國(guó)標(biāo)方法相比較，樣品處理簡(jiǎn)單只需經(jīng)離心、過濾即可檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過程時(shí)間有較大縮短。

本方法選擇桔汁中類黃酮成分之一橙皮苷作定量基準(zhǔn)峰，測(cè)定結(jié)果精密度較好，回收率為98%～103%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1%～3%之間；與國(guó)標(biāo)法結(jié)果對(duì)比相對(duì)誤差較小，滿足分析純鮮榨桔汁及其制品的桔汁含量的測(cè)定的要求。