周昊 劉奕 廖楚航 郭駿 費(fèi)偉

熱療(Hyperthermia)作為一種新興的治療惡性腫瘤的方法，副作用較小且無累積。以往的臨床研究已經(jīng)證實(shí)熱療在惡性腫瘤晚期、復(fù)發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性疾病的治療中都是有效的[1]。雖然熱療對(duì)惡性腫瘤的抑制作用已經(jīng)得到公認(rèn)，但是其潛在的分子機(jī)制仍不清楚。

轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factorβ，TGFβ)是一種多功能細(xì)胞因子，它可以通過抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移以及腫瘤組織血管生長[2-3]。Smad蛋白是TGFβ主要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，參與廣泛的生物學(xué)過程[4]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的TGFβ/Smad信號(hào)系統(tǒng)在上皮源性的惡性腫瘤(包括OSCC)的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[5-7]。而TGFβ/Smad信號(hào)系統(tǒng)與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)-A，促淋巴生成因子VEGF-D和VEGF-R3，促轉(zhuǎn)移因子uPAR和MMP都有著密切的關(guān)系，而這些因子的表達(dá)已經(jīng)被證實(shí)在熱療的過程中都發(fā)生了改變[8-11]。

本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)了熱療可抑制VEGF-C和-D在口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)中的表達(dá)[8]。同時(shí)，其他的一些基因如VEGF-A、尿激酶受體(Urokinase type plasminogen activator receptor，uPAR)、凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)以及基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)的表達(dá)在熱療的過程中都會(huì)發(fā)生改變[9-11]，這些結(jié)果均提示熱療可能通過改變一些腫瘤相關(guān)因子的表達(dá)來改變腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的特性。但是，TGFβ/Smad信號(hào)系統(tǒng)是否在熱療誘導(dǎo)的抗腫瘤機(jī)制中起重要的作用還未見相關(guān)報(bào)道。

本研究擬從基因水平和蛋白水平檢測熱療對(duì)OSCC動(dòng)物模型中TGFβ, Smad2, Smad3, Smad4和Smad7表達(dá)的影響，初步探尋TGFβ/Smad信號(hào)系統(tǒng)在熱療抗腫瘤過程中發(fā)揮的作用及其分子學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/C-nu/nu裸鼠，雌性， 4～5 周齡，體重15～20 g，飼養(yǎng)于無特異性病原菌，恒溫(20～26 ℃)，恒濕(45%～50%)的空氣潔凈的層流架內(nèi)。

1.2 腫瘤模型建立

實(shí)驗(yàn)所用口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca8113購自四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；基本實(shí)驗(yàn)步驟如下；細(xì)胞株從液氮冰存中復(fù)蘇，培養(yǎng)于RPMI培養(yǎng)液(15%滅活小牛血清，青霉素200 U/ml, 鏈霉素200 U/ml)， 37 ℃， 5% CO2培養(yǎng)箱。收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，制備濃度為1×107/ml細(xì)胞懸液，皮下接種于裸鼠雙側(cè)臀部，每個(gè)部位接種約0.1 ml。待腫瘤體積達(dá)到100 mm3，隨機(jī)將裸鼠分為加熱組(HT組)和未加熱組(C組)，每組10 只。

1.3 腫瘤加熱模型的建立

采用水浴加熱法給加熱組裸鼠局部腫瘤加熱。將荷瘤裸鼠予以戊巴比妥鈉鎮(zhèn)靜后，置于水浴箱內(nèi)加熱，腫瘤置于水面下至少1 cm，加熱條件： 42.5 ℃恒溫，加熱40 min[9]。使用小風(fēng)扇降溫避免全身加熱，并保持室內(nèi)溫度恒定。共加熱5次(每次間隔7 d)，最后1 次加熱7 d后處死裸鼠，同時(shí)處死未加熱組裸鼠，分離取出腫瘤組織，液氮保存，后轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱，備用。

1.4 RT-PCR檢測

取保存的腫瘤組織磨碎后加入Trizol(50 mg組織加入1 ml)抽提RNA，并用RevertAidTM試劑盒(Thermo, USA)逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA; 取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR(ABI Prism 7700，USA)。引物序列見表 1。

1.5 Western blot檢測

表 1 引物序列Tab 1 The sequences of the primers

使用蛋白提取試劑盒(KeyGEN, China)提取腫瘤組織蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒(Pierce, USA)測定蛋白濃度。蛋白變性后，冷卻上樣，凝膠電泳半干法轉(zhuǎn)入PVDF膜后置于封閉緩沖液(搖床振蕩1 h)，分別加入目標(biāo)基因一抗(Cell Signaling technology, 1∶10 000, USA)， 4 ℃過夜，TBS/T洗滌后孵育二抗，ECL顯影條帶并進(jìn)行灰度分析(Bio-Rad, USA)。

2 結(jié) 果

2.1 目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)變化

RT-PCR結(jié)果顯示： 2 組樣本中均檢測到目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)。加熱組中TGFβ、Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)比未加熱組明顯降低(P<0.05)，Smad7的mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而Smad4的mRNA表達(dá)變化無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 1)。

圖 1 TGFβ/Smad相關(guān)分子mRNA表達(dá)的變化(*: P<0.05)Fig 1 The mRNA levels of TGFβ/Smad relative factors (*: P<0.05)

2.2 目標(biāo)基因蛋白表達(dá)的變化

Western blot結(jié)果顯示：兩組中均檢測到目標(biāo)基因蛋白的表達(dá)。TGFβ、Smad7、Smad4蛋白的表達(dá)變化與mRNA表達(dá)變化一致，而Smad2和Smad3的表達(dá)無明顯變化，磷酸化的Smad2和Smad3(pSmad2和pSmad3)表達(dá)則明顯降低(P<0.05)(圖 2)。

圖 2 TGFβ/Smad相關(guān)分子蛋白表達(dá)的變化(*: P<0.05)Fig 2 The protein levels of TGFβ/Smad relative factors (*: P<0.05)

3 討 論

TGFβ被認(rèn)為是一種促腫瘤因子，它可以促進(jìn)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(Epithelial-mesenchymal-transition, EMT)，而EMT是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤獲得侵襲和遷移能力的重要生物學(xué)過程[12]，另外TGFβ還能夠通過自分泌和旁分泌機(jī)制，激活促轉(zhuǎn)移因子如VEGF、FGF、uPAR、MMP2/9 和 VEGFR3的表達(dá)，從而在惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[13-15]。Smad蛋白是TGFβ唯一的直接轉(zhuǎn)錄因子，它作為TGFβ主要的細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)分子，參與了廣泛的生物學(xué)進(jìn)程[9]?，F(xiàn)有8 種Smad蛋白被發(fā)現(xiàn)，TGFβ/Smad 信號(hào)通路包括R-Smad(Smad2和Smad3)、Co-Smad(Smad4)、I-Smad(Smad7)。研究證實(shí)，TGFβ/Smad信號(hào)系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中扮演重要的角色[2，7，12]。

腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞對(duì)于溫度更敏感，加熱可以使其內(nèi)皮細(xì)胞破裂，增加血管壁的粘附性以及血液的粘稠度， 繼而致血栓形成，最終導(dǎo)致腫瘤組織的破壞，熱療就是基于以上原理達(dá)到治療的作用[16-17]，其分子學(xué)機(jī)理還不清楚。本課題前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱療能夠抑制淋巴轉(zhuǎn)移因子VEGF-C和VEGF-D的表達(dá)[8]。本研究中檢測了熱療后OSCC動(dòng)物模型中TGFβ/Smad信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)因子的表達(dá)變化，初步探尋TGFβ/Smad信號(hào)系統(tǒng)在熱療對(duì)惡性腫瘤治療過程中所起的作用。結(jié)果顯示，對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行加熱后，腫瘤細(xì)胞中TGFβ、Smad2和Smad3的mRNA表達(dá)降低，Smad4的表達(dá)無明顯變化，而Smad7的表達(dá)明顯升高；蛋白的檢測結(jié)果略有不同，TGFβ、Smad4和Smad7的表達(dá)表達(dá)變化與mRNA表達(dá)一致，不同的是在加熱過后Smad2和Smad3的表達(dá)沒有變化，而 pSmad2和pSmad3的表達(dá)降低。在經(jīng)典的TGFβ/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路中，TGF-β首先激活I(lǐng)I型受體(typeII TGF-β receptor, TβRII)，隨后磷酸化I型跨膜受體(TβR I)，活化的TβRII再磷酸化R-Smad(Smad2和Smad3)，R-Smad的非活性發(fā)夾結(jié)構(gòu)活化之后與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，通過直接或者間接與DNA結(jié)合，與不同轉(zhuǎn)錄因子相互作用從而調(diào)控各種生物學(xué)效應(yīng)[4]。Xie等[18]對(duì)798例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Smad蛋白活性未受損的患者5年生存率大概為45%，而缺失pSmad2和pSmad3表達(dá)的患者5 年生存率為90%。這說明了磷酸化的R-Smad對(duì)于TGFβ/Smad信號(hào)的促腫瘤效應(yīng)至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)加熱之后pSmad2和pSmad3的蛋白表達(dá)降低，而Smad7的表達(dá)明顯升高。Smad7作為抑制型Smad(I-Smad)在TGFβ/Smad信號(hào)通路中起著抑制R-Smad磷酸化的作用，它可以競爭性抑制磷酸化Smad2/3和與TβRⅠ形成穩(wěn)定的復(fù)合體，Smad7還能與Smad泛素調(diào)節(jié)因子(Smad ubiquitinregulatory factors, Smurfs)結(jié)合抑制R-Smad磷酸化，從而抑制TGFβ信號(hào)[19-21]。TGFβ/Smad信號(hào)系統(tǒng)在熱療過程中可能是通過上調(diào)Smad7的表達(dá)，從而抑制Smad2和Smad3的磷酸化而達(dá)到抑制TGFβ所介導(dǎo)的促腫瘤效應(yīng)。

綜上所述，TGFβ/Smad信號(hào)系統(tǒng)在熱療所產(chǎn)生的抗腫瘤效應(yīng)中扮演著特定的角色，而Smad7對(duì)R-Smad磷酸化的抑制作用可能起著某種關(guān)鍵作用。