江靜 黎春暉 聶敏海

口臭主要由口腔微生物(革蘭氏陰性厭氧菌占多數(shù))對(duì)口腔中滯留物質(zhì)腐敗分解引起[1]。同時(shí)，口臭給就診患者帶來(lái)嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)和社交障礙。研究表明，口臭主要是由牙周致病菌內(nèi)含硫氨基酸的代謝產(chǎn)物增加所致，如硫化氫(H2S)、二甲硫醇[(CH3)2S]、甲硫醇(CH3SH)等[2]。口臭致病菌主要是厭氧菌，如牙齦卟啉菌(porphyromonasgingivalis,Pg)、中間普氏菌(prevotellaintermedia,Pi)、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)等[3]。資料顯示，超過(guò)80%的口臭患者通常是由多種菌株混合感染所致，且這類菌株在理化特性上極為相似[4]。因此，在研究患者口腔中口臭致病菌時(shí)，應(yīng)先了解感染菌群，有利于后期用藥。

口臭就診患者沒(méi)有年齡和性別的區(qū)分，病例的分布范圍也較廣。因此，臨床用藥也較為廣泛，最終細(xì)菌對(duì)某些臨床藥物產(chǎn)生耐藥性。臭氧水具有廣譜殺菌作用，可能具有清除口臭的作用。同時(shí)，臭氧水殺菌基本無(wú)毒副作用，為臨床上替代抗生素提供新思路。為此，本課題組從西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院(2017 年)收集到3 株臨床分離株，探討臭氧水的殺菌作用，以期達(dá)到除口臭的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)菌株 牙齦卟啉單胞菌(Pg)、具核梭桿菌(Fn)及中間普氏菌(Pi)來(lái)自2017 年西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院病人口腔中的分離株。

1.1.2 主要儀器 臭氧發(fā)生器(GX-188型，成都肯格王三氧電器設(shè)備有限公司)； 潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-2F，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)； 厭氧培養(yǎng)箱(YQX-Ⅱ，上海精其儀器有限公司)； 倒置生物顯微鏡(AE31，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)； 酶標(biāo)儀(Multlskan，賽默飛世爾儀器有限公司， 美國(guó))。

1.1.3 試劑 臭氧測(cè)定試劑盒(Lot：8304172， 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；革蘭氏染液(規(guī)格10 ml×4)；人工唾液(XH-002， 東莞市譽(yù)揚(yáng)檢測(cè)儀器有限公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；BHI血瓊脂平板(廣東環(huán)微生物科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌復(fù)蘇及傳代 將凍存管(菌株)表面用75%乙醇擦拭后移入潔凈工作臺(tái)，分別復(fù)蘇后各取100 μl到血平板上涂布培養(yǎng)。置入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為37 ℃(10% CO2， 80% N2， 10% H2)。培養(yǎng)3 d后，分別挑取具Fn、Pg、Pi單菌落進(jìn)行擴(kuò)增，收集菌體進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 革蘭氏染色鑒定 用吸水紙將載玻片擦干，在玻片上滴10 μl生理鹽水，接種環(huán)灼燒，待其冷卻后，挑取單個(gè)菌落均勻涂于玻片的生理鹽水上，待其自然干燥。再通過(guò)固定、95%乙醇染色、脫色、復(fù)染等，油鏡頭下觀察菌體形態(tài)。

1.2.3 PCR鑒定 DNA提?。喊丛噭┖姓f(shuō)明書(shū)操作。PCR擴(kuò)增：引物序列見(jiàn)表 1。

1.2.4 臭氧水的制備及測(cè)定方法 在環(huán)境溫度為25 ℃的條件下，將臭氧發(fā)生器產(chǎn)生的臭氧氣體以多孔砂棒通入盛有250 ml滅菌蒸餾水的具塞三角瓶中，并分別于臭氧水產(chǎn)生的每隔2 min 即2、 4、 6 min……關(guān)閉發(fā)生器，再用碘量法分別測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的臭氧水中臭氧濃度，并測(cè)得該臭氧發(fā)生器開(kāi)機(jī)所能獲得的最大臭氧水濃度以及獲得最大臭氧水濃度所需的時(shí)間。為減小實(shí)驗(yàn)誤差，此實(shí)驗(yàn)中所涉及的測(cè)量步驟均需重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3 次的平均值。

表 1 3 株菌的擴(kuò)增引物序列Tab 1 The amplification primer sequences of 3 strains of bacteria

1.2.5 臭氧水抑菌試驗(yàn) 取離心管并按如下方法加入試劑：實(shí)驗(yàn)組離心管中分別加入濃度為0.2、 0.1、 0.05 mg/L的臭氧水4.5 ml，陰性對(duì)照組離心管中加入蒸餾水4.5 ml，再分別各組的離心管中加入對(duì)應(yīng)細(xì)菌編號(hào)的0.5 ml菌懸液，分別作用30 s和60 s，適當(dāng)稀釋后取10 μl接種于實(shí)驗(yàn)用BHI血瓊脂培養(yǎng)基。在厭氧環(huán)境中(80% N2，10% H2，10% CO2)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落數(shù)CFU計(jì)數(shù)，計(jì)算出抑菌率，觀察在30 s和60 s作用時(shí)間下3 種不同濃度臭氧水的體外抑菌效果。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3 次的均值。采用人工唾液模擬正?？谇画h(huán)境，同樣條件下，觀察臭氧水的抑菌情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 革蘭染色結(jié)果

3 株菌經(jīng)革蘭染色后，油鏡下觀察可見(jiàn)中間普氏菌(圖 1A)為革蘭陰性球桿菌，牙齦卟啉單胞菌(圖 1B)為革蘭陰性短桿菌，具核梭桿菌(圖 1C)為革蘭陰性梭狀桿菌，形態(tài)特點(diǎn)與3 株菌的理論形態(tài)相符。

2.2 PCR鑒定結(jié)果

3 株菌經(jīng)PCR鑒定，結(jié)果顯示中間普氏菌，牙齦卟啉菌，具核梭桿菌分別在105、 194、 175 bp左右有一條清晰的條帶(圖 2)，與理論相符。

2.3 臭氧水濃度測(cè)定結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)時(shí)室溫下，采用目前的臭氧水制備條件下制備所得的臭氧水的最大濃度為0.2 mg/L, 對(duì)其進(jìn)行對(duì)倍稀釋，獲得3 個(gè)濃度分別為0.2、 0.1、 0.05 mg/L的臭氧水備用。

2.4 臭氧水抑菌試驗(yàn)結(jié)果

圖 1 3 種細(xì)菌的形態(tài)(×1 000)Fig 1 The morphology of the 3 bacteria stains

(×1 000)

1： 中間普氏菌； 2： 牙齦卟啉單胞菌； 3： 具核梭桿菌圖 2 Pi、 Pg、 Fn的16S rDNA PCR條帶譜圖結(jié)果Lane 1: Pi; Lane 2: Pg; Lane 3: FnFig 2 The 16SrDNA PCR bands of the 3 bacteria strans

臭氧水抑菌結(jié)果顯示，臭氧水在臭氧濃度在0.05、0.1、 0.2 mg/L 3 個(gè)濃度時(shí)對(duì)中間普氏菌，牙齦卟啉菌及具核梭桿菌均具有較好的抑制作用， 隨著臭氧濃度的降低，臭氧水對(duì)3 株菌的抑制效果也減弱，具有濃度依賴關(guān)系(表 2)。

2.5 人工唾液干擾臭氧水抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由表 3可知，在唾液的存在情況下，臭氧水在臭氧濃度為0.2、 0.1、 0.05 mg/L的臭氧水時(shí)對(duì)中間普氏菌，牙齦卟啉菌及具核梭桿菌均具有一定的抑制作用，同時(shí)隨著臭氧濃度的降低，臭氧水對(duì)3 株菌的抑制效果也減弱，具有濃度依賴關(guān)系。但抑菌作用較單純臭氧水相比顯著降低。

表 2 3 株菌的臭氧水抑菌試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The results of ozone water suppression test of 3 bacteria strains

表 3 人工唾液干擾臭氧水抑菌試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 The results of inhibition test of ozone water interfered by artificial saliva

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌及中間普氏菌等與口臭密切相關(guān)，郭興懷等[5]抽取43 例口臭患者細(xì)菌樣本，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)主要是牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌等構(gòu)成， 且主要牙周致病菌與口臭程度存在著高度相關(guān)性。肖晗等[6]發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌通過(guò)刺激IL-6的產(chǎn)生促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖。具核梭桿菌感染可導(dǎo)致腸胃炎，主要是該菌株誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞Caco-2凋亡，其具體機(jī)制可能與GADD34及GADD153基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)和AKT磷酸化下調(diào)密切相關(guān)[7]。中間普氏菌是產(chǎn)黑色素類革蘭氏陰性厭氧桿菌，沒(méi)有芽孢，是口臭患者十分常見(jiàn)的病原微生物[8]。潘亞萍等[9]通過(guò)細(xì)菌混合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，口臭患者口腔里的中間普氏菌變形鏈球菌與、血鏈球菌呈拮抗關(guān)系，與伴放線放線桿菌和具核梭桿菌呈共生關(guān)系。本課題基于3 株菌的嚴(yán)重危害性和普遍性，以其為研究對(duì)象，進(jìn)行深入探討。

抗生素可以有效殺死口臭致病菌，達(dá)到清除口臭的目的。但近年來(lái)，凸顯的耐藥性問(wèn)題讓不少醫(yī)務(wù)人員束手無(wú)策。因此，抗生素替代產(chǎn)品的挖掘任重道遠(yuǎn)。研究表明[10]，臭氧可以殺滅口腔患者中的部分病原微生物，且當(dāng)臭氧水濃度達(dá)到1.3 mg/L時(shí)，作用120 s后，對(duì)中間普雷沃菌殺菌率可達(dá)到100%。臭氧主要是依靠其強(qiáng)氧化性破壞細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)核酸，如嘌呤和嘧啶，破壞DNA復(fù)制，不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臭氧水具有降低口臭的作用。當(dāng)臭氧水濃度在0.05、 0.1、 0.2 mg/L時(shí)對(duì)3 種菌均具有較好的抑制作用，且隨著臭氧濃度的升高，抑制作用加強(qiáng)， 60 s作用效果比30 s強(qiáng)。臭氧水對(duì)口臭厭氧菌的作用時(shí)間是否與抑制率成線性關(guān)系，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用人工唾液來(lái)模擬口腔環(huán)境時(shí)，臭氧水抑菌作用降低。證明臨床應(yīng)用上，臭氧水還需要進(jìn)一步改進(jìn)。抑菌作用下降可能與人工唾液中的還原性金屬離子、緩沖液存在等有關(guān)，也可能與人工唾液的pH值、唾液流率及微觀成分的變化有關(guān)。本課題組將進(jìn)一步通過(guò)臨床試驗(yàn)來(lái)加以探索和研究。

4 結(jié) 論

臭氧水能夠?qū)诔粝嚓P(guān)細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，降低口臭。 0.2 mg/L和0.1 mg/L的臭氧水溶液對(duì)3 種菌的抑制效果均明顯高于0.05 mg/L的臭氧水溶液對(duì)3 株菌的抑制效果，臨床上為達(dá)到良好的治療效果，應(yīng)使用濃度≥0.1 mg/L的臭氧水溶液，且作用時(shí)間以達(dá)到60 s為宜。但實(shí)際應(yīng)用中，還可能存在不少缺陷。因此，需要進(jìn)一步深入研究。