楊 豐， 李 鈁

(自然資源部第三海洋研究所、海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén)361005)

血細(xì)胞是甲殼動(dòng)物的免疫細(xì)胞，負(fù)責(zé)執(zhí)行體液免疫和細(xì)胞免疫，抵御和清除入侵的病原。保證循環(huán)系統(tǒng)中血細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)是維持一個(gè)有效免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)。成熟血細(xì)胞均具有一定的壽命，在正常生理?xiàng)l件下需要不斷更新；在發(fā)生感染的情況下，血細(xì)胞被大量招募用于清除病原，會(huì)在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生較多的損耗；此外，由于甲殼動(dòng)物好斗的特性，常常會(huì)發(fā)生外傷導(dǎo)致血細(xì)胞流失；以上情況都需要造血組織(hematopoietic tissue)產(chǎn)生新的血細(xì)胞來(lái)加以補(bǔ)充。因此活躍的造血能力，對(duì)保證機(jī)體的健康乃至存活都是非常重要的。相對(duì)脊椎動(dòng)物而言，人們對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物造血(hematopoiesis)機(jī)制的認(rèn)識(shí)很有限，本文對(duì)近年來(lái)在甲殼動(dòng)物造血機(jī)制的研究上取得的進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。

1 甲殼動(dòng)物血細(xì)胞的類(lèi)型與功能

1.1 血細(xì)胞的類(lèi)型

甲殼動(dòng)物的血細(xì)胞根據(jù)形態(tài)特征可大致分成3類(lèi)：透明細(xì)胞(hyaline/agranular cell, HC)，半顆粒細(xì)胞/小顆粒細(xì)胞(semigranular cell/small granular cell, SGC)和顆粒血細(xì)胞/大顆粒細(xì)胞(granular cell/large granule cell, GC)[1-2]。其中HC體積最小，核質(zhì)比最大，細(xì)胞中不含或者含有少量的胞質(zhì)顆粒；GC體積最大，核質(zhì)比最小，細(xì)胞質(zhì)中充滿(mǎn)了體積較大的顆粒；SGC體積中等，核質(zhì)比較小，含有較多胞質(zhì)顆粒，但是其顆粒的體積小于GC[3]。研究表明，在不同的物種中，血細(xì)胞的類(lèi)型組成以及不同類(lèi)型細(xì)胞的豐度存在一定的差異。在螯蝦和對(duì)蝦中，SGC和GC是主要的血細(xì)胞，而HC含量較低，研究者認(rèn)為其可能是提前被釋放的未充分分化的細(xì)胞[3-5]；但對(duì)一些蟹類(lèi)的研究表明HC是主要的血細(xì)胞[6]。這種根據(jù)形態(tài)學(xué)特征來(lái)區(qū)分細(xì)胞類(lèi)型的方法比較原始、主觀(guān)性強(qiáng)，因此研究者對(duì)不同物種血細(xì)胞類(lèi)型的判別，甚至不同研究者針對(duì)同一物種的血細(xì)胞類(lèi)型判別均可能存在差異。

1.2 血細(xì)胞功能

血細(xì)胞是甲殼動(dòng)物的主要免疫細(xì)胞，負(fù)責(zé)執(zhí)行細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。其中細(xì)胞免疫主要包括對(duì)外來(lái)異物的吞噬、包囊、結(jié)節(jié)作用[1, 7]；體液免疫主要包括酚氧化酶原系統(tǒng)參與的黑化過(guò)程、凝固蛋白參與的凝血反應(yīng)，以及抗菌肽對(duì)病原的殺傷等[8-10]。已有的研究表明，不同類(lèi)群的細(xì)胞在免疫反應(yīng)中扮演不同的角色。其中HC、SGC和GC均可參與對(duì)異物的吞噬；SGC負(fù)責(zé)執(zhí)行對(duì)較大異物的包囊作用；GC是酚氧化酶酶系的主要儲(chǔ)存細(xì)胞，在一定條件下GC中的酚氧化酶酶系被釋放并活化，啟動(dòng)黑化反應(yīng)；此外，GC還負(fù)責(zé)儲(chǔ)存和釋放抗菌肽、蛋白酶抑制劑等免疫活性物質(zhì)[1, 10]。

1.3 有待解決的問(wèn)題

目前對(duì)血細(xì)胞功能的研究主要以血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分類(lèi)為基礎(chǔ)。然而，同樣的形態(tài)學(xué)類(lèi)群中可能還存在不同的功能亞群[5]。對(duì)血細(xì)胞功能亞群的鑒定，以及準(zhǔn)確的血細(xì)胞分型，將有賴(lài)于血細(xì)胞分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，以及基于分子標(biāo)記的細(xì)胞功能分析。近年來(lái)有研究者依據(jù)血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分類(lèi)，從mRNA和蛋白水平對(duì)相應(yīng)的分子標(biāo)記進(jìn)行了篩選，獲得了一些在不同血細(xì)胞中特異性表達(dá)的標(biāo)記分子，為研究甲殼動(dòng)物血細(xì)胞功能分型奠定了基礎(chǔ)[11-13]。但這些標(biāo)記分子與血細(xì)胞功能亞群的對(duì)應(yīng)關(guān)系，以及在不同甲殼動(dòng)物中的適用性還有待進(jìn)一步研究。

2 甲殼動(dòng)物的造血組織

造血指的是從造血干細(xì)胞/前體細(xì)胞分化產(chǎn)生成熟血細(xì)胞并釋放到血液循環(huán)的過(guò)程。人們對(duì)甲殼動(dòng)物造血機(jī)制的探索可追溯到18世紀(jì)末，早期的研究者憑借顯微觀(guān)察在多種甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了造血組織存在的證據(jù)[3]。近年來(lái)的研究主要集中在十足目甲殼類(lèi)動(dòng)物特別是淡水螯蝦中[3, 14-19]，此外在對(duì)蝦[20-23]、蟹類(lèi)[24-26]、龍蝦[27]中也進(jìn)行了一些探索。十足目甲殼動(dòng)物的造血組織通常位于胃部背側(cè)，是一薄片狀組織，造血干細(xì)胞/前體血細(xì)胞被包裹在由結(jié)締組織構(gòu)成的小葉中。

2.1 造血組織細(xì)胞的類(lèi)型

研究者根據(jù)造血組織小葉中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征(包括細(xì)胞大小、胞質(zhì)顆粒以及細(xì)胞器發(fā)育情況等)，對(duì)其進(jìn)行了初步的分類(lèi)，并對(duì)細(xì)胞所處分化階段進(jìn)行了推測(cè)。

Chaga等(1995)認(rèn)為，螯蝦(Pacifastacusleniusculus)的造血組織包括了5種類(lèi)型的細(xì)胞[14]。其中1型和2型細(xì)胞均具有分裂能力，可分化為SGC與GC。1型細(xì)胞可能是造血干細(xì)胞，占8%左右，這類(lèi)細(xì)胞排列緊密的分布于小葉背側(cè)，可進(jìn)一步發(fā)育為2型細(xì)胞；2型細(xì)胞占總數(shù)30%左右，緊鄰1型細(xì)胞層分布在小葉內(nèi)側(cè)，細(xì)胞的組織比較松散，這類(lèi)細(xì)胞增殖最為旺盛。3型和4型細(xì)胞含有與GC類(lèi)似的顆粒，可能是GC的前體，其中3型細(xì)胞含量最高，占55%。5型細(xì)胞含有很多細(xì)小的胞質(zhì)顆粒，可能是SGC的前體。3、4、5型細(xì)胞均不具備分裂能力。

Martin等(1993)認(rèn)為，龍蝦(Homarusamericanus)的造血組織中包含了兩個(gè)譜系的干細(xì)胞和成熟血細(xì)胞[27]。其一是透明細(xì)胞譜系，包括透明型干細(xì)胞，以及處于不同分化階段的透明細(xì)胞；其二是顆粒細(xì)胞譜系，根據(jù)不同的分化階段，分為顆粒型干細(xì)胞、小顆粒型干細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、顆粒細(xì)胞。每個(gè)小葉通常同時(shí)包含兩個(gè)譜系的細(xì)胞。在造血組織中透明細(xì)胞譜系占9.5%，顆粒細(xì)胞譜系占90.5%。

Van de Braak等(2002)認(rèn)為，對(duì)蝦(Penaeusmonodon)的造血組織包含了4種主要的細(xì)胞類(lèi)型[20]：1型細(xì)胞是前體細(xì)胞，可進(jìn)一步分化為2型(未成熟SGC)和3型(未成熟GC)細(xì)胞，而4型細(xì)胞為間質(zhì)細(xì)胞。其中1～3型細(xì)胞均可分裂。作者認(rèn)為造血組織中的2、3型細(xì)胞與傳統(tǒng)意義上血液循環(huán)中的HC類(lèi)似，推測(cè)2、3型細(xì)胞以HC的形式被釋放后，在循環(huán)中成熟為SGC和GC。其中部分GC可能在結(jié)締組織中分化成熟并儲(chǔ)存。需要指出的是，早期研究認(rèn)為類(lèi)淋巴器是對(duì)蝦的造血組織，后來(lái)這個(gè)觀(guān)點(diǎn)被證明是錯(cuò)誤的，類(lèi)淋巴器可能是一個(gè)血淋巴的過(guò)濾器官，負(fù)責(zé)過(guò)濾收集循環(huán)血中的病原，并通過(guò)活躍的吞噬作用將其清除[28]。

2.2 造血組織中細(xì)胞的組織形式

根據(jù)對(duì)螯蝦[14]、對(duì)蝦[20]、龍蝦[27]等的研究，十足目甲殼動(dòng)物造血組織小葉中細(xì)胞的組織形式存在類(lèi)似的規(guī)律。造血組織小葉結(jié)構(gòu)具有極性，在其一側(cè)存在開(kāi)口(結(jié)締組織缺失)。小葉中的細(xì)胞按分化程度呈梯度分布：分化程度低的細(xì)胞緊密排列于遠(yuǎn)離開(kāi)口的一側(cè)(在螯蝦中描述為小葉的背側(cè)，在對(duì)蝦中描述為小葉的外周)；分化程度較高的細(xì)胞松散排列于小葉的內(nèi)部；即將成熟的血細(xì)胞位于小葉開(kāi)口附近，并可能由此處釋放到循環(huán)中。此外，對(duì)螯蝦的研究表明，位于造血組織不同部位的細(xì)胞存在差異，螯蝦造血組織的前端與大腦相鄰的部位存在一個(gè)復(fù)制中心(anterior proliferation center, APC)[29]。與造血組織后部相比，APC細(xì)胞分化程度較低、增殖旺盛。從該部位分離的細(xì)胞在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中也與來(lái)源于造血組織后部的細(xì)胞存在差異，細(xì)胞因子Astakine 1在體外無(wú)法誘導(dǎo)APC細(xì)胞的分化。推測(cè)APC可能是造血干細(xì)胞集中分布之處。

2.3 有待解決的問(wèn)題

已有的研究?jī)H是基于形態(tài)學(xué)特征對(duì)甲殼動(dòng)物的造血組織細(xì)胞進(jìn)行了類(lèi)型區(qū)分，并根據(jù)其胞質(zhì)顆粒的有無(wú)和多少以及細(xì)胞器發(fā)育情況等將其與循環(huán)血細(xì)胞對(duì)應(yīng)關(guān)聯(lián)。至于這些細(xì)胞之間以及它們與循環(huán)血細(xì)胞類(lèi)型之間的關(guān)系還缺乏直接的證據(jù)。

3 血細(xì)胞的分化途徑

甲殼動(dòng)物血細(xì)胞的分化途徑目前是不明確的。研究者推測(cè)，螯蝦和對(duì)蝦的血細(xì)胞可能是雙向分化，即：造血干細(xì)胞先分別分化為SGC和GC的前體，然后再進(jìn)一步發(fā)育為SGC和GC[14, 20]，但是這一推測(cè)尚缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)。根據(jù)我們的研究，螯蝦血淋巴中GC的比例通常小于35%，但體外培養(yǎng)的螯蝦造血組織細(xì)胞中有60%以上具有分化為GC的能力，而且未成熟GC的形態(tài)特征與循環(huán)中的SGC非常類(lèi)似[17]。上述發(fā)現(xiàn)提示血細(xì)胞也存在單向分化的可能，即只有一種細(xì)胞譜系，分化途徑是造血干細(xì)胞-前體血細(xì)胞-SGC-GC。此外，對(duì)螯蝦[14]、對(duì)蝦[20]和龍蝦[27]造血組織的形態(tài)學(xué)研究表明，該組織中不含(或僅含有極少量的)成熟GC，且這些極少量的GC可能是由血淋巴攜帶進(jìn)組織的。因此，GC應(yīng)該是分化到一定階段就被釋放到血液循環(huán)并在其中逐步發(fā)育成熟的。血淋巴中含有多大比例的未成熟GC，這些細(xì)胞如何進(jìn)一步發(fā)育也是未知的。因此甲殼動(dòng)物血細(xì)胞的分化途徑到底如何還需要更深入的研究。

4 甲殼動(dòng)物造血的調(diào)控機(jī)制

4.1 參與造血調(diào)控的分子

甲殼動(dòng)物的造血過(guò)程受到蛻皮周期[27, 30]、病原感染[20, 31-33]、失血[20, 34]以及晝夜節(jié)律等因素[35]的影響。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些蛋白可能參與了甲殼動(dòng)物造血的調(diào)控，其中最重要的是細(xì)胞因子Astakine。Astakine是一類(lèi)與脊椎動(dòng)物Prokineticin同源的蛋白。Prokineticin類(lèi)蛋白參與了脊椎動(dòng)物的血管生成、神經(jīng)生成，以及晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)等過(guò)程[19]。目前在甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了兩種類(lèi)Astakine亞型， Astakine1和Astakine2 (簡(jiǎn)稱(chēng)AST1，AST2)。AST1是一類(lèi)造血組織生長(zhǎng)因子，主要由SGC產(chǎn)生并分泌到血淋巴中。AST1在體外可以促進(jìn)造血組織細(xì)胞的增殖，注射AST1則可以引起循環(huán)血細(xì)胞的增加，而抑制AST1的表達(dá)則會(huì)阻礙新血細(xì)胞的產(chǎn)生[33]。內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明，AST1可能具有誘導(dǎo)造血組織細(xì)胞分化為SGC的能力[36]。不僅如此，AST1還可以通過(guò)上調(diào)甲殼動(dòng)物造血因子(crustacean hematopoietic factor，CHF)的表達(dá)來(lái)抑制造血組織細(xì)胞的凋亡[37]。因此AST1可通過(guò)促增殖和抑凋亡兩個(gè)途徑來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的造血能力。此外，其他一些造血調(diào)節(jié)因子可能通過(guò)與AST1相互作用來(lái)發(fā)揮功能，例如：AST1和β胸腺素都能結(jié)合細(xì)胞表面的ATP合成酶, AST1可以促進(jìn)胸腺素的分泌，胸腺素又可以促進(jìn)AST1的表達(dá)，二者通過(guò)復(fù)雜的相互作用影響造血組織細(xì)胞的增殖、遷移和釋放[38-39]；抗菌肽Crustin Pm4以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase, TGase)可以通過(guò)結(jié)合AST-1的3’-UTR抑制AST1蛋白的翻譯[23]；五羥色胺可以通過(guò)促進(jìn)血細(xì)胞分泌A(yíng)ST1來(lái)調(diào)節(jié)造血組織細(xì)胞的增殖[18]。

與AST-1不同， AST2不能促進(jìn)血細(xì)胞的增加，但它可以引起血淋巴中GC比例的上升，因此該蛋白可能與GC分化成熟有關(guān)[36]。此外，AST2在造血組織中的表達(dá)受晝夜節(jié)律影響顯著，并可以介導(dǎo)褪黑素對(duì)生物鐘的調(diào)節(jié)，可能參與調(diào)控造血的晝夜節(jié)律變化[35]。

此外在對(duì)蝦中還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子(hemocyte homeostasis-associated protein，HHAP)，該蛋白在造血組織中高表達(dá)，敲低其表達(dá)會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，并導(dǎo)致對(duì)蝦在30 h之內(nèi)迅速死亡[21]。說(shuō)明HHAP對(duì)維持對(duì)蝦循環(huán)血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)非常重要，可能與造血能力的維持有關(guān)。不過(guò)在螯蝦發(fā)現(xiàn)的HHAP同源蛋白并不具有上述功能[40]。

4.2 胞外基質(zhì)與造血的關(guān)系

對(duì)脊椎動(dòng)物的研究表明，胞外基質(zhì)參與調(diào)節(jié)造血組織/器官的微環(huán)境，影響造血干細(xì)胞/前體血細(xì)胞的增殖、更新與分化等過(guò)程[41]。螯蝦的造血組織細(xì)胞是由結(jié)締組織包裹，胞外基質(zhì)的主要成分包括膠原蛋白[3, 14]和凝血蛋白[42]等，它們共同維持造血組織的微環(huán)境，影響造血干細(xì)胞/前體血細(xì)胞的分化狀態(tài)。TGase在調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)中扮演了重要的角色。TGase是一類(lèi)負(fù)責(zé)催化甲殼動(dòng)物凝血過(guò)程的酶，它能催化蛋白質(zhì)賴(lài)氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-酰胺基結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)之間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)。TGase在甲殼動(dòng)物的造血組織中高表達(dá)[16, 22]，在對(duì)螯蝦造血組織塊的體外培養(yǎng)中研究者發(fā)現(xiàn)，組織內(nèi)部的TGase表達(dá)量很高，而從組織塊外遷的細(xì)胞TGase表達(dá)量顯著降低；而抑制TGase表達(dá)會(huì)引起原代造血組織細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變[16]。上述發(fā)現(xiàn)說(shuō)明TGase在維持造血組織細(xì)胞干性方面可能有一定的作用。進(jìn)一步的研究表明，AST1可以非競(jìng)爭(zhēng)性抑制TGase的活性，導(dǎo)致胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，從而促進(jìn)造血組織細(xì)胞的分化和新生血細(xì)胞釋放[19]。此外，血小板生成因子/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor/vascular endothelial growth factor)家族的蛋白也可以通過(guò)抑制TGase來(lái)調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)血細(xì)胞的分化[43]。

4.3 有待解決的問(wèn)題

在上述對(duì)甲殼動(dòng)物造血調(diào)控機(jī)制的研究中，研究者主要是根據(jù)原代造血組織細(xì)胞的貼壁鋪展和遷移情況來(lái)判斷其是否分化，缺乏直接證據(jù)。此外，在上述研究中，對(duì)于有新血細(xì)胞產(chǎn)生的判斷標(biāo)準(zhǔn)是循環(huán)血細(xì)胞數(shù)量的增加，無(wú)法排除固著血細(xì)胞[44-47]釋放產(chǎn)生的影響。因此，到底哪些因子在血細(xì)胞分化、成熟和釋放的過(guò)程中起到調(diào)控作用還有待進(jìn)一步證實(shí)。

5 造血組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

2005年瑞典學(xué)者建立了螯蝦造血組織細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法[33]。他們利用膠原酶將造血組織消化，得到單細(xì)胞懸液，并于添加了螯蝦血漿的L15培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)。造血組織細(xì)胞存活時(shí)間可達(dá)8～12周。隨后，他們從螯蝦血漿中分離出能夠促進(jìn)造血組織細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞因子AST1[33]。Liu等(2007)利用組蛋白H2A為轉(zhuǎn)染試劑，建立了適用于螯蝦造血組織細(xì)胞的RNA干擾技術(shù)[48]。此后原代培養(yǎng)的螯蝦造血組織細(xì)胞被廣泛用于造血機(jī)制和免疫功能的研究[16, 37, 49-51]。Shi等(2018)建立了基于這一原代培養(yǎng)細(xì)胞的外源基因轉(zhuǎn)染方法[52]，進(jìn)一步為開(kāi)展基因功能研究提供了便利。本課題組Li等(2019)利用螯蝦肌肉提取液成功的誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的造血組織細(xì)胞分化為GC[17]，建立了甲殼動(dòng)物血細(xì)胞分化的體外模型，為深入研究甲殼動(dòng)物血細(xì)胞分化掃除了技術(shù)障礙。

6 展望

雖然近年來(lái)對(duì)甲殼動(dòng)物造血機(jī)制的研究取得了較大的進(jìn)展，但是還有許多基本的問(wèn)題懸而未決。比如：造血組織中到底存在哪些不同分化階段的細(xì)胞，它們與循環(huán)血細(xì)胞之間到底是什么關(guān)系？血細(xì)胞的分化途徑是怎樣的，受哪些因子的調(diào)控？血細(xì)胞分化成熟及新舊更替的速度如何？病原感染對(duì)造血過(guò)程有何影響？對(duì)這些問(wèn)題的探究將深化我們對(duì)甲殼動(dòng)物造血機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并有助于了解動(dòng)物造血機(jī)制的演化過(guò)程。