高莉，霍仕霞，譚雪，彭曉明，閆明

(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830049)

驅(qū)蟲斑鳩菊(VernoniaanthelminticaWilld.)是維吾爾醫(yī)治療白癜風(fēng)方劑中最常采用的藥材，維吾爾醫(yī)認(rèn)為驅(qū)蟲斑鳩菊可以通過清除患者體內(nèi)過盛黏液質(zhì)，促進(jìn)色素沉著，恢復(fù)皮膚顏色，從而治療白癜風(fēng)[1]。有研究表明[2-4]，紫鉚花素是驅(qū)蟲斑鳩菊的主要有效成分之一，對體外培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞的黑色素合成和黑色素合成相關(guān)的酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)活性有調(diào)節(jié)作用，提示其可能對白癜風(fēng)等色素性疾病具有一定應(yīng)用開發(fā)前景。然而，人體內(nèi)黑色素合成是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，它由黑色素細(xì)胞內(nèi)合成，通過黑色素細(xì)胞樹枝狀突起被傳遞到鄰近角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)，并隨角質(zhì)形成細(xì)胞向表皮上層移動(dòng)，從而影響皮膚顏色[5-6]。因此，筆者在文獻(xiàn)[4]基礎(chǔ)上，采用A375細(xì)胞和Hacat細(xì)胞共培養(yǎng)體系進(jìn)一步考察紫鉚花素對黑色素合成功能的作用，以期深入研究紫鉚花素治療白癜風(fēng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人黑色素瘤細(xì)胞A375，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT，武漢大學(xué)細(xì)胞庫提供。

1.2藥品與試劑 紫鉚花素(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所自制，批號：20151208，含量≥95%)；Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-High glucose(DMEM)干粉培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：1645780)；胎牛血清(美國HycLone公司，批號：NZJ1221)；噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT，美國Amresco公司，批號：YY11351)；左旋多巴(L-DOPA，美國Sigma公司，批號：LC0922B5011J)； Trizol(Invitrogen，批號：149101)；M-MLV First Strand Kit(Invitrogen，批號：8212007)；SYBR Green qPCR SuperMix(Invitrogen，批號：8212113)；TYR1 F：GCTTTCCTGTCCTACCC，R：GCTTTCCTGTCCTACCC；β-actin F：CCTAGACTTCGAGCAAGAGA，R：GGAAGGAAGGCTGGAAGA；常規(guī)生化試劑購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 電子分析天平(德國Sartorius公司，型號：SQP，感量：0.01 mg)；生物安全柜(上海蘇凈公司，型號：YJ-875)；倒置顯微鏡(上海光學(xué)六廠，型號：37XB)；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司，型號：MCO-18AIC)；生化培養(yǎng)箱(上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司，型號：SPX-150B-Z)；酶標(biāo)儀(德國Thermo公司，型號：Go 1510)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad 公司，型號：CFX96)。

1.4方法

1.4.1紫鉚花素母液的配制 精密稱取紫鉚花素樣品0.1 g，以二甲亞砜(DMSO)溶解，配制成100 g·L-1母液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2共培養(yǎng)細(xì)胞體系的建立 取對數(shù)生長期角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰酶1 mL消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度為5×105·mL-1密度，接種到需要規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)板中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)6 h使細(xì)胞充分貼壁；取對數(shù)生長期黑色素瘤細(xì)胞A375，每個(gè)培養(yǎng)瓶加入0.25%胰酶1 mL消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度為2.5×105·mL-1密度，接種于已有角質(zhì)形成HaCaT細(xì)胞貼壁生長的細(xì)胞培養(yǎng)板中，使角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT和黑色素瘤細(xì)胞A375接種比例為2：1，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中24 h。

1.4.3MTT法檢測細(xì)胞增殖率[7]建立共培養(yǎng)細(xì)胞體系，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，分別加入終濃度0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 μg·mL-1含紫鉚花素培養(yǎng)液，另設(shè)不加藥物的陰性對照組，即黑色素瘤細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系，空白對照組(不含細(xì)胞，僅加入相同體積培養(yǎng)液，用于計(jì)算細(xì)胞增殖率時(shí)消除溶液本底誤差)。每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，陰性對照組和空白對照組以及紫鉚花素各給藥組每孔均加入5 g·L-1MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，上述每孔加入DMSO200 μL，震蕩10 min，使結(jié)晶完全溶解，立即于酶標(biāo)儀490 nm波長處測定吸光度值(A值)，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=[(加藥組A值-空白對照組A值) /(陰性對照組A值-空白對照組A值)]×100%。

1.4.4酶學(xué)方法測定TYR活性 建立共培養(yǎng)細(xì)胞體系，培養(yǎng)24 h后，設(shè)不同濃度(0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 μg·mL-1)紫鉚花素組，另設(shè)不加藥物的陰性對照組即黑色素瘤細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系和不接種細(xì)胞僅加入相同體積培養(yǎng)液的空白對照組(本組不含細(xì)胞，僅用于計(jì)算TYR活性時(shí)消除溶液本底誤差)。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。給藥48 h后，采用多巴氧化速率法測定每組的TYR活性，酶標(biāo)儀測定490 nm處A值，測定各組的TYR活性[5]。TYR活性(%)=(加藥組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。

1.4.5氫氧化鈉(NaOH)裂解法測定黑色素合成 建立共培養(yǎng)細(xì)胞體系，培養(yǎng)24 h后，設(shè)不同濃度(0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 μg·mL-1)紫鉚花素組，另設(shè)不加藥物的陰性對照組即黑色素瘤細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系)和不接種細(xì)胞僅加入相同體積培養(yǎng)液的空白對照組(不含細(xì)胞，僅用于計(jì)算黑色素合成率時(shí)消除溶液本底誤差)。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。給藥48 h后采用NaOH裂解法測定細(xì)胞黑色素含量，酶標(biāo)儀測定460 nm波長處A值。黑色素合成率(%)=(加藥組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。

1.4.6酪氨酸相關(guān)蛋白1(tyrosine-related protein-1，TRP-1)、酪氨酸相關(guān)蛋白2(tyrosine-related protein -2，TRP-2)基因表達(dá)的檢測 建立共培養(yǎng)細(xì)胞體系，培養(yǎng)24 h，設(shè)陰性對照組和不同濃度(0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 μg·mL-1)紫鉚花素組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。給藥48 h后收集細(xì)胞，Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，取RNA 5 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測RNA完整性，然后使用反轉(zhuǎn)錄酶按40 μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行cDNA純化、RNA電泳并檢測RNA濃度，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)檢測。

2 結(jié)果

2.1紫鉚花素對黑色素瘤細(xì)胞A375和角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT共培養(yǎng)細(xì)胞體系細(xì)胞增殖率的影響 MTT結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，A375細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)體系與不同濃度紫鉚花素共孵育48 h后，1.0，5.0 μg·mL-1紫鉚花素組細(xì)胞增殖率顯著增高(P<0.05或P<0.01)，10.0 μg·mL-1紫鉚花素組細(xì)胞存活率則被明顯抑制(P<0.01)。見表1。

表16組細(xì)胞增殖率測定結(jié)果

組別劑量/(μg·mL-1)A490增殖率/%陰性對照組-0.68±0.04100.00±5.87紫鉚花素組0.10.62±0.0389.98±4.620.50.67±0.1197.70±16.651.00.76±0.08*1111.56±11.87*15.00.80±0.13*2118.48±20.50*210.00.38±0.04*252.59±5.72*2

與陰性對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

2.2紫鉚花素對人黑色素瘤細(xì)胞A375和角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT共培養(yǎng)體系TYR含量的影響L-Dopa氧化速率法測定TYR活性，結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，1.0，5.0 μg·mL-1紫鉚花素能明顯上調(diào)黑色素瘤細(xì)胞A375和角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT共培養(yǎng)體系中A375細(xì)胞TYR活性(P<0.05 或P<0.01)。5.0 μg·mL-1紫鉚花素促進(jìn)作用最強(qiáng)(P<0.01)，見表2。

表26組細(xì)胞TYR活性測定結(jié)果

組別劑量/(μg·mL-1)A490TYR活性/%陰性對照組-0.12±0.01106.05±17.75紫鉚花素組0.10.13±0.02118.45±28.800.50.12±0.01104.26±17.831.00.14±0.03*1142.13±39.83*15.00.18±0.01*2199.85±11.45*210.00.11±0.1496.50±22.38

與陰性對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

2.3紫鉚花素對黑色素瘤細(xì)胞A375和角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT共培養(yǎng)體系黑色素合成的影響 NaOH裂解法結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，在0.5～5.0 μg·mL-1濃度范圍，各劑量紫鉚花素組黑色素合成率均明顯提高(P<0.05 或P<0.01)，紫鉚花素5.0 μg·mL-1時(shí)，促黑色素合成作用最強(qiáng)(P<0.01)。見表3。

表36組細(xì)胞中黑色素合成率測定結(jié)果

組別劑量/(μg·mL-1)A490黑色素合成率/%陰性對照組-0.08±0.01100.00±23.41紫鉚花素組0.10.10±0.01130.87±29.110.50.10±0.01*1151.55±2806*11.00.10±0.00*1153.10±3.85*15.00.12±0.02*2191.78±58.54*210.00.08±0.0181.02±16.56

與陰性對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01.

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

2.4紫鉚花素對黑色素瘤細(xì)胞A375 和角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT共培養(yǎng)體系中TYR活性相關(guān)基因TRP-1、TRP-2 mRNA表達(dá)的影響 Realtime PCR檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，在0.1～5.0 μg·mL-1濃度范圍，紫鉚花素各劑量組黑色素細(xì)胞TRP-1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)、在0.5～5.0 μg·mL-1濃度范圍、紫鉚花素各劑量組黑色素細(xì)胞TRP-2 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)，且紫鉚花素為1.0 μg·mL-1時(shí)作用最強(qiáng)。見表4。

表46組細(xì)胞中TRP-1、TRP-2mRNA表達(dá)測定結(jié)果

組別劑量/(μg·mL-1)TRP-1 mRNATRP-2 mRNA陰性對照組-1.00±0.001.00±0.00紫鉚花素組0.11.13±0.05*11.01±0.070.51.22±0.02*21.18±0.03*21.01.42±0.07*21.42±0.06*25.01.40±0.03*21.38±0.02*210.00.98±0.071.00±0.11

與陰性對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

3 討論

白癜風(fēng)是一種由于黑色素細(xì)胞選擇性破壞所致的皮膚獲得性慢性色素脫失病[8]。表現(xiàn)為皮膚或毛發(fā)中黑色素細(xì)胞功能喪失，或兩者兼而有之，導(dǎo)致皮膚產(chǎn)生白斑[9]。研究認(rèn)為，該病主要由黑色素細(xì)胞的破壞和黑色素合成途徑阻塞造成。黑色素由黑色素細(xì)胞內(nèi)合成，傳遞到鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞，并隨角質(zhì)形成細(xì)胞向表皮上層移動(dòng)，影響皮膚顏色[10]。黑色素在黑色素小體中由多巴醌合成，其合成受酶級聯(lián)調(diào)節(jié)，TYR是黑色素生成的限速酶，酪氨酸家族基因TRP-1、TRP-2負(fù)責(zé)色素沉著的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[8]。

紫鉚花素是驅(qū)蟲斑鳩菊有效成分，對體外單獨(dú)培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞A375的黑色素合成和TYR活性的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)得到證明[11]。筆者在本實(shí)驗(yàn)考察不同濃度紫鉚花素作用于A375細(xì)胞和Hacat細(xì)胞共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)0.5，1.0，5.0 μg·mL-1紫鉚花素可明顯促進(jìn)共培養(yǎng)細(xì)胞增殖及黑色素細(xì)胞TYR活性和黑色素合成，顯著提高TRP-1、TRP-2 mRNA表達(dá)，但紫鉚花素在10.0 μg·mL-1時(shí)表現(xiàn)出明顯抑制共培養(yǎng)體系細(xì)胞增殖率以及黑色素合成的作用，提示紫鉚花素促進(jìn)共培養(yǎng)體系細(xì)胞增殖與濃度有關(guān)，超過一定濃度能夠?qū)?xì)胞增殖形成抑制，該藥可能存在一定的細(xì)胞毒性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫鉚花素促進(jìn)共培養(yǎng)體系細(xì)胞TYR活性和黑色素合成的濃度與體外單獨(dú)培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞A375一致，但其促進(jìn)作用明顯增強(qiáng)，提示紫鉚花素可以通過作用于Hacat細(xì)胞促進(jìn)黑色素細(xì)胞黑色素形成，該結(jié)果與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，說明紫鉚花素促進(jìn)黑色素合成的作用機(jī)制不僅與A375細(xì)胞和Hacat細(xì)胞相關(guān)，還與上述兩種細(xì)胞間相互作用有關(guān)。

A375細(xì)胞和Hacat細(xì)胞共培養(yǎng)能較好地模擬表皮微環(huán)境，筆者在本實(shí)驗(yàn)中觀察到紫鉚花素明顯促進(jìn)共培養(yǎng)細(xì)胞的黑色素合成以及提高TRP-1、TRP-2 mRNA表達(dá)，說明調(diào)節(jié)TRP-1、TRP-2基因表達(dá)以及影響A375細(xì)胞和Hacat細(xì)胞之間的相互作用，可能是紫鉚花素治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制之一，但其是否能促進(jìn)黑色素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)及其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚不明確，需要繼續(xù)研究。