黃未劼，張同輝，蔡澤宇，龐聰，沈枕，方攀，潘經(jīng)媛

(1.武漢大學藥學院，武漢 430071；2.湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司，武漢 430061；3.武漢雙龍藥業(yè)有限公司，武漢 430075)

柴連感冒顆粒處方為臨床應用多年的經(jīng)驗方，由柴胡、川連、黃芩、赤芍、蔓荊等中藥組成提取的復方制劑，具有解表宣肺、化濕和中之功，主要用于治療感冒風寒、風寒挾濕證者。為研究該制劑的長期毒性反應，根據(jù)新藥長期毒性指導原則和方法[1-3]，臨床給藥為7 d，因此筆者采用大鼠連續(xù)灌胃給藥31 d，利用受試動物的各項生理病理指標評價藥物的安全性，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1藥物 柴連感冒顆粒(湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司研發(fā)中心制備提供，批號：20130603)，每1 g干膏粉相當于生藥3.51 g，臨用時每100 g干膏粉加揮發(fā)油0.62 mL混勻。

1.2實驗動物 SPF級SD大鼠，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。給藥時體質量：雌性大鼠152.4～173.4 g，雄性大鼠167.1～190.8 g。均6～7周齡，共120只，雌雄各半。實驗動物生產合格證號：SCXK(滬)2013-0016，實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2009-0023。將大鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)，明暗各12 h交替，室溫20.7～23.5 ℃，相對濕度43.3%～69.0%。SPF大鼠繁殖顆粒飼料(批號：14023113)和玉米芯墊料(批號：14019811)均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供；飼料經(jīng)60Co滅菌處理，墊料經(jīng)134 ℃、7 min高壓滅菌后使用。飲用水為高壓滅菌水，符合生活飲用水衛(wèi)生標準GB5749-85要求。實驗前大鼠檢疫5 d，觀察記錄大鼠行為活動、攝食量、體質量、精神狀況等，選擇健康、正常大鼠作為受試動物，若雌性則用無孕大鼠。

1.3儀器 3700全自動血球分析儀(美國雅培公司)，CA-1500全自動血凝分析儀[希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司]，7100全自動生化分析儀(日本日立公司)，CAV2101電子天平和Adventurer-AR3130電子天平[奧豪斯(上海)有限公司]，TP 1020全自動脫水儀和EG1140全自動包埋儀(德國LEICA公司)、HM360輪轉切片機(德國MICROM公司) 和 E600光學顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.4實驗方法 將大鼠按性別和體質量分層隨機分為柴連感冒顆粒大、中、小劑量組(給藥劑量以生藥計，分別為45.0，24.0和12.0 g·kg-1，分別相當于人臨床日擬用量的52，28，14倍)及溶媒對照組(給予純化水)，每組30只，雌雄各半，每日灌胃給藥1次，劑量20 mL·kg-1，連續(xù)31 d。

1.5觀察指標 給藥期間每周測量體質量和攝食量1次，并根據(jù)測得的體質量調整給藥量，給藥期間每天觀察并記錄動物行為、活動等情況。連續(xù)給藥31 d后各組取大鼠16只(雌雄各半)，停藥14 d后各取14只(雌雄各半)，禁食12 h，進行血液學和血液生化學檢查，稱取臟器質量，計算質量指數(shù)。①血液學指標：紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)、紅細胞容積(HCT)、平均紅細胞容積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白(average red blood cell hemoglobin，MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin contentration，MCHC)、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)(reticulocyte count，RET)、白細胞計數(shù)及其分類(white blood cell count and its classification，WBC&DC)、血小板計數(shù)(blood platelet，PLT)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、凝血酶時間(thrombin time，TT)；②血液生化學指標：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Crea)、白蛋白(ALB) 、總蛋白(TP)、總膽紅素(T-BiL)、血糖(GLU)、三酰甘油 (TG)、總膽固醇(total cholesterol，T-CH)、 K+濃度、Cl-濃度、Na+濃度、肌酸磷酸激酶(creatine phosphate kinase，CK)。③系統(tǒng)尸體解剖：對各臟器全面肉眼尸檢；④臟器稱重：稱心、肝、腎、脾、肺、腦、胸腺、腎上腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮質量，并計算臟器系數(shù)；⑤病理組織學檢查：腦(大腦、小腦、腦干)，脊髓(頸、胸、腰段)，垂體，胸腺，甲狀腺，甲狀旁腺，食管，唾液腺，胃，小腸和大腸，肝臟，腎臟，腎上腺，脾臟，胰腺，氣管，肺臟，主動脈，心臟，附睪，睪丸，卵巢，子宮，前列腺，乳腺，坐骨神經(jīng)，膀胱，淋巴結和骨髓及所有異常組織，10%甲醛溶液固定，進行病理組織學檢測。

2 結果

2.1一般狀況、體質量、進食量 4組大鼠實驗期間一般行為無異常，毛色光潔，腺體分泌、呼吸、糞便性狀正常，實驗期間均無死亡。

4組大鼠體質量均增長，其中柴連感冒顆粒大劑量組雄性大鼠體質量增長較溶媒對照組慢(P<0.01或P<0.05)，柴連感冒顆粒大劑量組雌性大鼠體質量與溶媒對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，見表1，2。

與溶媒對照組比較，柴連感冒顆粒各劑量組雌性大鼠進食量均差異無統(tǒng)計學意義，柴連感冒顆粒大劑給藥期，n=15；恢復期，n=7量組雄性大鼠給藥第7天，第14天進食量減少(P<0.01)，見表3，4。

表14組雌性大鼠不同時間體質量測定結果

組別給藥0 d給藥7 d給藥14 d給藥21 d給藥28 d給藥31 d停藥7 d停藥14 d溶媒對照組 162±6 194±10 218±13 239±15 249±13 258±14 274±18 280±16柴連感冒顆粒 小劑量組 162±6 193±10 213±9 227±14 240±12 247±15 268±17 277±14 中劑量組 162±6 195±13 219±13 240±15 254±18 261±20 266±11 277±10 大劑量組 162±6 190±8 213±7 234±12 251±13 258±14 262±9 272±10

Treatment period,n=15; recovery period,n=7

表24組雄性大鼠不同時間體質量測定結果

組別給藥0 d給藥7 d給藥14 d給藥21 d給藥28 d給藥31 d停藥7 d停藥14 d溶媒對照組 177±6 232±10 287±12 329±15 361±17 379±16 411±17 438±20柴連感冒顆粒 小劑量組 177±5 230±12 283±13 328±17 358±19 376±23 410±18 436±18 中劑量組 177±6 231±8 286±11 329±16 355±23 372±24 402±22 426±26 大劑量組 177±5 212±8*1 257±11*1 293±12*1 320±14*1 333±15*1 378±15*1 407±15*2

給藥期，n=15；恢復期，n=7。與溶媒對照組比較*1P<0.01，*2P<0.05

Treatment period，n=15；recovery period，n=7。Compared with control group，*1P<0.01，*2P<0.05

2.2血常規(guī)檢查結果 與溶媒對照組比較，柴連感冒顆粒中、大劑量組血常規(guī)均差異無統(tǒng)計學意義，柴連感冒顆粒小劑量組TT高于溶媒對照組(P<0.05)，其他血常規(guī)指標差異無統(tǒng)計學意義。見表5。

2.3血液生化指標檢查結果 連續(xù)給藥31 d，與溶媒對照組比較，柴連感冒顆粒小劑量組生化指標差異無統(tǒng)計學意義；柴連感冒顆粒中劑量組GLU、T-CHO低于溶媒對照組(P<0.01)，Cl-、Na+濃度高于溶媒對照組(P<0.05)；柴連感冒顆粒大劑量組GLU 和T-CHO低于溶媒對照組(P<0.01)，TG高于溶媒對照組(P<0.05)。結果見表6。

停藥14 d后，柴連感冒顆粒小、中劑量組AST、CK低于溶媒對照組(P<0.01)，柴連感冒顆粒中、大劑量組BUN高于溶媒對照組(P<0.05,P<0.01)。結果見表6。

2.4系統(tǒng)尸檢及臟器系數(shù) 連續(xù)給藥31 d及停藥14 d，大體解剖檢查未見明顯異常。連續(xù)給藥31 d，柴連感冒顆粒大劑量組雌性大鼠肝、腎上腺系數(shù)高于溶媒對照組(P<0.01)，胸腺系數(shù)低于溶媒對照組(P<0.01)；柴連感冒顆粒大劑量組雄性大鼠肝、腎上腺系數(shù)高于溶媒對照組(P<0.01)。停藥14 d，柴連感冒顆粒小劑量雌性大鼠組子宮系數(shù)高于溶媒對照組(P<0.05)；柴連感冒顆粒大劑量組雄性大鼠腦系數(shù)高于溶媒對照組(P<0.05)。結果見表7、表8。

2.5組織學檢查 連續(xù)給藥31 d及停藥14 d，柴連感冒顆粒大劑量組有個別大鼠出現(xiàn)盲腸黏膜下出血，肝淤血、脂肪變性，肝髓外造血，肺間質增生，肺泡增厚，腎小管上皮細胞變性、腫脹，管腔內有絲網(wǎng)狀物分布，間質細胞增生，腎實質萎縮，膀胱黏膜上皮細胞變性脫落，胸腺髓質出血，但這些病變同樣出現(xiàn)在溶媒對照組，且病變例數(shù)與病變程度無明顯差異，這些病變也是SD大鼠常見自發(fā)性病變[4]，故上述變化與供試品無關。

表34組雌性大鼠不同時間進食量測定結果

Tab.3Food-intakeoffourgroupsoffemaleratsatdifferenttimepoints

g·(100 g)

給藥期，n=8；恢復期，n=7(n為籠數(shù))

Treatment period,n=8; recovery period,n=7(n means cage number)

表44組雄性大鼠不同時間進食量測定結果

Tab.4Food-intakeoffourgroupsofmaleratsatdifferenttimepoints

g·(100 g)

與溶媒對照組比較，*1P<0.01；給藥期，n=8；恢復期，n=7(n為籠數(shù))

Compared with control group，*1P<0.01；Treatment period,n=8; recovery period,n=7(n means cage number)

表54組大鼠血液學指標檢查結果

Tab.5Resultsofhematologicalexaminationinfourgroupsofrats

組別與時間RET/%RBC/(×1012·L-1)Hb/(g·L-1)HCT/%MCV/flMCH/pgMCHC/(g·L-1)WBC/(×109·L-1)給藥31 d(n=16) 溶媒對照組4.70±2.527.17±0.60138±1064.6±4.290.5±2.719.3±0.4213±35.41±1.23 柴連感冒顆粒 小劑量組3.26±1.467.17±0.63137±1163.4±5.088.5±1.919.0±0.4215±24.87±2.18 中劑量組4.02±2.686.92±0.63132±961.5±3.989.1±3.619.1±0.7214±24.91±0.96 大劑量組3.69±1.637.13±0.68134±1062.7±4.488.2±3.018.9±0.7214±36.82±2.44停藥14 d(n=14) 溶媒對照組4.36±0.927.19±0.62133±763.7±2.988.9±4.218.6±0.7209±44.39±1.36 柴連感冒顆粒 小劑量組4.78±0.677.02±0.45133±762.5±2.589.2±3.618.9±0.4212±54.09±1.79 中劑量組4.26±0.597.20±0.60134±863.7±3.988.6±3.218.7±0.7211±34.16±1.10 大劑量組4.78±0.887.00±0.33130±562.2±2.289.0±2.518.7±0.4210±34.84±1.06組別與時間NEULYMMONOEOSBASO%PLT/(×109·L-1)PTTTs給藥31 d(n=16) 溶媒對照組12±482±53±21±02±1 912±6210.1±0.9 56±4 柴連感冒顆粒 小劑量組14±680±63±11±02±1 950±6310.2±2.3 60±4*1 中劑量組13±782±93±11±02±1 962±659.7±1.7 57±4 大劑量組14±681±83±21±02±1 924±6810.3±1.4 55±4停藥14 d(n=14) 溶媒對照組11±485±52±11±02±1 882±9511.8±2.5 62±5 柴連感冒顆粒 小劑量組10±486±52±11±01±0 940±9111.3±1.3 62±4 中劑量組9±387±22±11±12±1 868±21811.5±1.8 61±4 大劑量組11±585±52±11±02±1 928±10111.9±2.7 60±4

與溶媒對照組比較，*1P<0.05

Compared with solvent control group*1P< 0.05

表64組大鼠血液生化指標測定結果

Tab.6Resultofbloodbiochemicalindexinfourgroupsofrats

組別與時間ALTASTALPCK(U·L-1)TPALB(g·L-1)T-BiLCrea(μmol·L-1)給藥31 d(n=16) 溶媒對照組48±6 90±7116±41 317±7458±234±22.3±0.941±3柴連感冒顆粒 小劑量組52±9 90±10117±40 307±9560±335±21.8±0.740±2 中劑量組49±8 92±20127±37 321±14259±334±12.4±0.941±3 大劑量組54±9 90±19149±39 353±25360±335±12.4±0.942±4停藥14 d(n=14) 溶媒對照組45±7 98±998±41 379±7759±234±12.3±0.946±3 柴連感冒顆粒 小劑量組49±6 81±15*195±29 214±124*159±334±12.4±0.946±5 中劑量組48±7 77±8*196±42 204±62*160±334±21.5±0.847±5 大劑量組48±9 91±11118±47 328±9160±335±22.1±0.745±4

續(xù)表64組大鼠血液生化指標測定結果

Tab.6Resultofbloodbiochemicalindexinfourgroupsofrats

組別與時間GLUBUNT-CHOTGK+Na+Cl-(mmol·L-1)給藥31 d(n=16) 溶媒對照組7.6±0.86.4±1.01.41±0.32 0.46±0.084.9±0.4 147±2 103±2 柴連感冒顆粒 小劑量組7.0±0.96.2±0.71.20±0.22 0.47±0.114.9±0.3 148±2 105±2 中劑量組6.6±0.7*16.6±1.41.00±0.25*1 0.51±0.204.8±0.3 149±2*2 106±2*2 大劑量組6.6±0.8*16.9±1.80.77±0.23*1 0.62±0.22*25.1±0.2 146±2 105±2停藥14 d(n=14) 溶媒對照組7.2±0.56.5±0.71.68±0.39 0.50±0.174.6±0.4 139±1 103±2 柴連感冒顆粒 小劑量組7.4±1.06.9±0.81.87±0.36 0.52±0.204.3±0.2 139±1 104±2 中劑量組7.6±0.67.5±0.9*21.68±0.34 0.44±0.074.5±0.4 139±1 104±2 大劑量組6.9±0.57.6±1.1*11.87±0.39 0.53±0.114.9±0.4 139±1 103±2

與溶媒對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with solvent control group，*1P<0.01，*2P<0.05

表74組雌性大鼠臟器系數(shù)測定結果

組別與時間心系數(shù)肝系數(shù)腎系數(shù)脾系數(shù)肺系數(shù)給藥31 d(n=8) 溶媒對照組0.354±0.0183.309±0.4250.752±0.0420.248±0.0380.407±0.027 柴連感冒顆粒 小劑量組0.359±0.0253.564±0.2870.798±0.0490.254±0.0440.421±0.024 中劑量組0.355±0.0163.713±0.2580.815±0.0600.292±0.0470.396±0.032 大劑量組0.363±0.0143.989±0.316*10.798±0.0600.260±0.0510.332±0.122停藥14 d(n=7) 溶媒對照組0.331±0.0142.720±0.1530.698±0.0420.252±0.0330.392±0.031 柴連感冒顆粒 小劑量組0.335±0.0152.652±0.1280.697±0.0380.237±0.0160.376±0.011 中劑量組0.335±0.0292.915±0.2720.709±0.0330.228±0.0190.391±0.025 大劑量組0.369±0.0702.928±0.1770.727±0.0610.259±0.0200.400±0.025組別與時間腎上腺系數(shù)腦系數(shù)卵巢系數(shù)子宮系數(shù)胸腺系數(shù)給藥31 d(n=8) 溶媒對照組0.031±0.0040.701±0.0360.055±0.0110.217±0.0600.224±0.028 柴連感冒顆粒 小劑量組0.033±0.0040.724±0.0420.082±0.0910.234±0.1020.193±0.027 中劑量組0.034±0.0060.726±0.0950.058±0.0100.224±0.0580.198±0.035 大劑量組0.039±0.003*10.687±0.0520.055±0.0070.187±0.0190.169±0.014*1停藥14 d(n=7) 溶媒對照組0.029±0.0040.664±0.0480.050±0.0040.178±0.0410.185±0.036 柴連感冒顆粒 小劑量組0.029±0.030.669±0.0450.051±0.0040.249±0.060*20.167±0.010 中劑量組0.029±0.0030.675±0.0420.043±0.0050.171±0.0450.160±0.031 大劑量組0.030±0.0020.704±0.0900.052±0.0140.176±0.0510.174±0.029

與溶媒對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with solvent control group，*1P<0.01，*2P<0.05

表84組雄性大鼠臟器系數(shù)測定結果

組別與時間心系數(shù)肝系數(shù)腎系數(shù)脾系數(shù)肺系數(shù)給藥31 d(n=8) 溶媒對照組0.324±0.0183.107±0.2200.805±0.1200.212±0.0320.336±0.020 柴連感冒顆粒 小劑量組0.332±0.0223.317±0.3080.809±0.0850.200±0.0270.354±0.036 中劑量組0.334±0.0393.336±0.3290.889±0.0900.223±0.0400.351±0.027 大劑量組0.341±0.0123.536±0.190*10.853±0.0380.209±0.0150.360±0.029停藥14 d(n=7) 溶媒對照組0.309±0.0212.949±0.2980.710±0.0290.215±0.0310.304±0.020 柴連感冒顆粒 小劑量組0.316±0.0193.020±0.3350.696±0.0210.234±0.0300.295±0.010 中劑量組0.307±0.0292.973±0.1160.720±0.0710.203±0.0180.310±0.017 大劑量組0.316±0.0103.102±0.1230.767±0.0640.226±0.0250.312±0.019組別與時間腎上腺系數(shù)腦系數(shù)卵巢系數(shù)子宮系數(shù)胸腺系數(shù)給藥31 d(n=8) 溶媒對照組0.015±0.0020.515±0.0320.734±0.0460.234±0.0350.144±0.026 柴連感冒顆粒 小劑量組0.017±0.0010.528±0.0450.734±0.0780.230±0.0300.133±0.026 中劑量組0.017±0.0010.526±0.0480.719±0.0820.227±0.0260.131±0.033 大劑量組0.021±0.003*10.557±0.0280.773±0.0610.242±0.0300.123±0.016停藥14 d(n=7) 溶媒對照組0.014±0.0020.446±0.0220.608±0.0270.226±0.0260.124±0.023 柴連感冒顆粒 小劑量組0.013±0.0020.455±0.0270.631±0.0370.230±0.0150.121±0.010 中劑量組0.014±0.0020.450±0.0220.625±0.0610.230±0.0130.115±0.019 大劑量組0.015±0.0010.490±0.038*20.641±0.0510.244±0.0300.110±0.023

與溶媒對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with solvent control group，*1P<0.01，*2P<0.05

3 討論

根據(jù)長期毒性相關指導原則[1-2]，劑量設計時大劑量應出現(xiàn)明顯毒性反應或達到最大給藥量，或系統(tǒng)暴露量達到臨床系統(tǒng)暴露量的50倍。由于考慮供試品最高配制濃度(太黏稠致灌胃針難以推送)、給藥體積及實驗期限等因素，采用最大濃度0.641 g浸膏粉·mL-1(生藥2.25 g·mL-1)×20 mL·kg-1=生藥45 g·kg-1，即設大劑量，相當于臨床擬用劑量的52倍；小劑量為生藥12 g·kg-1，高于大鼠藥效學有效劑量(生藥10 g·kg-1)，中劑量為生藥24 g·kg-1，由于給藥期設為31 d，因此恢復期設為14 d。

本實驗結果顯示，連續(xù)31 d灌胃給予不同劑量柴連感冒顆粒，各組大鼠實驗期間一般狀況無異常改變；大鼠體質量均增長，其中柴連感冒顆粒大劑量組雄性大鼠體質量較溶媒對照組增長緩慢，由于給藥濃度較高，且雄性大鼠體質量較大增加給藥難度，對給藥操作可能有一定影響。雌性大鼠體質量增長無異常。提示大劑量柴連感冒顆粒能使雄性大鼠體質量增長減緩。攝食量檢查，柴連感冒顆粒小、中劑量組與溶媒對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，柴連感冒顆粒大劑量組雄性大鼠給藥7～14 d進食量減少，雌性大鼠進食量無影響，提示大劑量柴連感冒顆粒在給藥初期對雄性大鼠攝食量有短暫抑制作用。

血液學檢查結果顯示，各劑量組血液學各項指標均未見異常，提示柴連感冒顆粒對血液學各項指標無影響。凝血檢查結果顯示，給藥末期柴連感冒顆粒小劑量組TT高于溶媒對照組，但絕對值相差不大，且無明顯劑量相關性，故該變化與供試品無關。血液生化結果顯示，給藥末期及恢復期結束，個別指標如GLU、AST、BUN、TG、CK、Na+和Cl-與對照組比較偶有統(tǒng)計學差異，但均在本安全評價中心背景值或參考文獻正常值范圍內[5]，故這些變化無毒理學評價意義。給藥末期，柴連感冒顆粒中、大劑量組T-CHO低于溶媒對照組，但柴連感冒顆粒中劑量組測定值在正常值范圍內，柴連感冒顆粒大劑量組測定值略低于正常值范圍，該變化可能為大劑量柴連感冒顆粒對雄性大鼠攝食量有短暫抑制作用而引起的動物營養(yǎng)不良所致，但恢復期可恢復正常。提示大劑量柴連感冒顆?？赡軐χx有可逆性影響。

臟器系數(shù)檢查結果顯示，連續(xù)給藥31 d，柴連感冒顆粒大劑量組雌性大鼠胸腺系數(shù)低于溶媒對照組，停藥14 d，柴連感冒顆粒小劑量組雌性大鼠子宮系數(shù)高于溶媒對照組，柴連感冒顆粒大劑量組雄性大鼠腦系數(shù)高于溶媒對照組，上述變化差異較小，且無明顯劑量相關性，故與供試品無關。連續(xù)給藥31 d，柴連感冒顆粒大劑量組肝系數(shù)和腎上腺系數(shù)高于溶媒對照組，結合血液生化和組織病理學檢查結果，均未見相關組織異常改變，且停藥后可恢復正常，故這些變化應無毒理學評價意義。

組織病理學檢查結果顯示，給藥末期和恢復期各組個別臟器病變例數(shù)和病變程度無差異，考慮為大鼠的自發(fā)性病變，與柴連感冒顆粒無關，其余臟器未見異常。

綜上所述，在本實驗條件下，柴連感冒顆粒對大鼠重復灌胃給藥31 d，45.0 g·kg-1時會導致雄性大鼠體質量增長減緩、給藥初期攝食量減少，膽固醇降低，停藥后逐漸恢復；柴連感冒顆粒對大鼠重復灌胃給藥31 d無毒反應劑量為24.0 g·kg-1，相當于臨床擬用劑量的28倍。