岳應(yīng)權(quán)， 馬曉萍， 高曉勤

遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校組織胚胎學(xué)教研室(貴州遵義 563006)

解脲脲原體(ureaplasma urealyticum, Uu) 是人類泌尿生殖道感染的常見病原體[1]，研究表明，Uu 吸附于精子，可影響精子穿透卵細(xì)胞的能力和干擾精子與卵細(xì)胞受精并導(dǎo)致不育[2-3]。研究證實(shí), 人腎臟的雙羰基/ L-木酮糖還原酶(dicarbonyl/L-xylulose reductase, DCXR)與附睪精子蛋白P34H是同一個(gè)蛋白[4]。精子DCXR(即P34H)是由附睪上皮分泌并定位于精子頂體部位的精子表面蛋白，精子在通過附睪時(shí)獲得DCXR這種蛋白質(zhì)，在人類精子與卵子的相互作用非常重要，且DCXR蛋白表達(dá)下降與男性不育有關(guān)[5]；DCXR的檢測可以作為診斷男性不育癥的一項(xiàng)重要指標(biāo)[6]。本研究為探討Uu感染對精子DCXR蛋白的表達(dá)量和精子凋亡的影響，以闡明 Uu感染引起男性不育的機(jī)制，為臨床診斷和治療男性不育以提供基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015 年7 月至2016 年11 月貴州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診就診男性不育癥患者145例。年齡23～42歲，均為婚后1年以上不育(經(jīng)婦科檢查排除女方不孕因素)，無外傷、遺傳性疾病家族史及性功能障礙病史，生殖系統(tǒng)無器質(zhì)性病變，精漿及血清抗精子抗體陰性，精液細(xì)菌培養(yǎng)陰性，血清衣原體抗體陰性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，且患者知情同意。

1.2 主要試劑 Percoll分離液(美國Pharmacia公司)；DCXR小鼠單克隆抗體(美國Abcam公司)；Alexa Fluor?594標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)；DAPI染色液(美國Abcam公司)；Uu 培養(yǎng)鑒定試劑盒(珠海迪爾公司)； TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德公司)；精子細(xì)胞BWW培養(yǎng)液(美國Toscience公司)；RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham Bioscience 公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 精液采集與分析 無菌采集精液，待完全液化后，進(jìn)行精液常規(guī)檢查(輔助精子分析儀型號: CASASQH-Ⅲ型)，檢測分析精液常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)(精子濃度、精子活力、精子形態(tài)等)。嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行，對精液進(jìn)行Uu 培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗(yàn)，根據(jù)精液Uu培養(yǎng)結(jié)果將不育患者分為Uu陽性不育組與Uu陰性不育組。采用Uu 敏感的抗生素對Uu 陽性者進(jìn)行治療，停藥6周后待Uu 培養(yǎng)轉(zhuǎn)為陰性后再次檢測精液質(zhì)量。

1.3.2 Western blot檢測精子DCXR蛋白表達(dá) 精液標(biāo)本采用密度梯度法離心分離出成熟精子。收集精子并懸浮洗滌2次，顯微鏡下調(diào)整精子濃度為2.0×107·mL-1。加入RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，提取蛋白50 μg經(jīng)12%SDS-PAGE 電泳分離后, 轉(zhuǎn)至PVDF膜， TBS封閉后加小鼠單克隆抗體DCXR(1∶1 000 稀釋)，4℃緩慢振蕩過夜 ； 次日加 HRP 標(biāo)記的酶標(biāo)二抗(1∶10 000 稀釋)，洗膜后ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描。蛋白的相對表達(dá)量用目標(biāo)蛋白積分吸光度與內(nèi)參蛋白β-actin吸光度比值表示。

1.3.3 免疫熒光檢測DCXR蛋白在精子的定位 多聚賴氨酸載玻片上滴加獲能后的精子懸液并室溫干燥，4%多聚甲醛固定，血清封閉液進(jìn)行封閉。加入小鼠單克隆抗體DCXR(1∶400 稀釋)，4℃過夜。洗滌后加Alexa Fluor?594標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶100稀釋)室溫孵育。DAPI染色孵育后PBS 漂洗后封片。用激光共聚焦顯微鏡觀察并照相，分別隨機(jī)選取多個(gè)視野攝片，計(jì)數(shù)精子DCXR標(biāo)記陽性率，每組計(jì)數(shù)200個(gè)精子。

1.3.4 精子DNA鏈完整性的檢測(TUNEL法) 嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行TUNEL細(xì)胞凋亡檢測。4%多聚甲醛室溫下固定精液涂片, PBS洗滌并用3% H2O2于室溫處理;滴入稀釋的ProteinaseK于標(biāo)本片, TBS洗滌。標(biāo)本片加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)和地高辛標(biāo)記的脫氧核苷酸(DIG-dUTP)的標(biāo)記液標(biāo)記,DAB顯色后光鏡鏡檢。在上述實(shí)驗(yàn)步驟中，標(biāo)本片不加TdT酶的作為陰性對照組。精子凋亡為精子頭部呈棕黃色染色為陽性。計(jì)算精子凋亡率，計(jì)數(shù)精子200個(gè)以上。

2 結(jié)果

2.1 Uu陽性不育組與Uu陰性不育組的精液常規(guī)檢測結(jié)果 145例不育組中，精液Uu培養(yǎng)結(jié)果陽性47例，陽性率32.41%。Uu陽性不育組與Uu陰性不育組精液分析結(jié)果見表1。對Uu 陽性者給予Uu 敏感的抗生素治療，停藥6周后，Uu 培養(yǎng)陰性后再次進(jìn)行精液常規(guī)檢測。治療后Uu陽性不育組的精子密度、精子活動率和精子正常形態(tài)率均明顯高于Uu陽性不育組治療前(P<0.05)。

組別例數(shù)精子密度(×106·mL-1)精子活動率(%)精子正常形態(tài)率(%)Uu陰性不育組9885.14±11.2656.58±6.3128.63±4.05Uu 陽性不育組(治療前)4764.32±8.15?31.12±4.94?13.36±3.87?Uu 陽性不育組(治療后)72.78±9.29#42.49±6.29#23.68±5.75#

*與Uu陰性不育組比較P<0.05；#與Uu 陽性不育組(治療前)比較P<0.05

2.2 Uu陽性不育組與Uu陰性不育組的精子DCXR蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示各不育組中精子多數(shù)存在DCXR蛋白的表達(dá),Uu陽性不育組精子DCXR/β-actin 平均光密度均低于Uu陰性不育組(P<0.05)。見圖1、表2，對Uu 陽性者進(jìn)行Uu 敏感的抗生素治療，治療后Uu陽性不育組的DCXR/β-actin 平均光密度明顯高于Uu陽性不育組治療前(P<0.05)。

A:Uu陰性不育組; B: Uu陽性不育組(治療前); C: Uu 陽性不育組(治療后)

圖1 Western blot檢測DCXR蛋白在精子的表達(dá)

2.3 Uu陽性不育組與Uu陰性不育組的精子DCXR蛋白定位 Uu陽性不育組中多數(shù)精子頂體

組別例數(shù)DCXR/β-actin相對表達(dá)量精子DCXR標(biāo)記陽性率(%)Uu陰性不育組980.45±0.1472.78±8.57Uu 陽性不育組(治療前)470.26±0.06?34.65±6.07?Uu 陽性不育組(治療后)0.34±0.08#45.77±7.46#

*與Uu陰性不育組比較P<0.05；#與Uu 陽性不育組(治療前)比較P<0.05

處DCXR表達(dá)不均勻，熒光強(qiáng)度較弱，熒光陰性的精子數(shù)較多，見圖2、表2，對Uu 陽性者進(jìn)行Uu 敏感的抗生素治療，治療后Uu陽性不育組的精子DCXR陽性率明顯高于Uu陽性不育組治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:Uu陰性不育組; B: Uu陽性不育組(治療前); C: Uu 陽性不育組(治療后)；箭頭示P34H蛋白在精子頂體的陽性表達(dá)

2.4 Uu陽性不育組與Uu陰性不育組的精子凋亡率 結(jié)果顯示Uu陽性不育組的精子凋亡率高于Uu陰性不育組(P<0.05)，見圖3、表3，對Uu 陽性者進(jìn)行Uu 敏感的抗生素治療，治療后Uu陽性不育組的精子凋亡率明顯低于Uu陽性不育組治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:Uu陰性不育組; B: Uu陽性不育組(治療前); C: Uu 陽性不育組(治療后)

2.5 精子DCXR蛋白表達(dá)量和精子DCXR陽性率與精子凋亡率的相關(guān)性 相關(guān)性分析提示精子DCXR蛋白表達(dá)量與精子凋亡率存在負(fù)相關(guān)性(r=-0.427,P<0.01)；精子DCXR陽性率與精子凋亡率存在負(fù)相關(guān)性(r=-0.562；P<0.01)。

3 討論

Uu是引起男性泌尿生殖道感染的常見病原體，常寄居于泌尿生殖道，引起非淋菌性尿道炎、慢性前列腺炎、附睪炎等，導(dǎo)致男性不育[7]。精子在附睪內(nèi)達(dá)到功能成熟從而獲得受精能力，并依賴附睪合成和分泌的蛋白產(chǎn)生作用[8]。研究報(bào)道，DCXR可作為一種“兼職蛋白”在人附睪組織中發(fā)揮其酶活性和蛋白結(jié)合特性，DCXR既可作為精子在附睪達(dá)到成熟的標(biāo)志物[5]，同時(shí)還具有L-木酮糖還原酶和雙羰基還原酶活性，可殺滅附睪液中的細(xì)菌[9]。研究表明DCXR還可表達(dá)在附睪上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，具有清除附睪液及精漿中的某些對精子造成損傷的有毒物質(zhì)的作用[9]。本研究對UU陽性不育者給予敏感抗生素治療，并對治療前后的精子蛋白DCXR表達(dá)和精子凋亡率進(jìn)行檢測分析，探討Uu 感染對精子蛋白DCXR表達(dá)和精子凋亡率的影響。

組別例數(shù)精子凋亡陽性率(%)Uu陰性不育組986.72±1.36Uu 陽性不育組(治療前)4717.13±2.3?Uu 陽性不育組(治療后)8.98±1.45#

*與Uu陰性不育組比較P<0.05；#與Uu 陽性不育組(治療前)比較P<0.05

本研究結(jié)果顯示Uu陽性不育組的精子DCXR蛋白表達(dá)量明顯低于與Uu陰性不育組，對Uu 陽性者進(jìn)行Uu 敏感的抗生素治療，治療后Uu陽性不育組的精子DCXR蛋白表達(dá)量明顯高于治療前Uu陽性不育組。通過免疫熒光方法清晰顯示DCXR定位于人精子頂體帽區(qū)，Uu陽性不育組的DCXR蛋白在精子頂體處的熒光強(qiáng)度和陽性率大幅減弱。進(jìn)行Uu 敏感的抗生素治療后，Uu陽性不育組部分精子DCXR陽性率升高。從結(jié)果可知，Uu 感染陽性不育者經(jīng)治療后其精子DCXR蛋白表達(dá)量和精子DCXR陽性率均較治療前升高。研究已證實(shí)Uu 感染可廣泛引起睪丸病理損傷并影響睪丸功能，干擾精子發(fā)生過程[10]。我們推測Uu 感染可能會引起附睪功能紊亂并導(dǎo)致DCXR蛋白表達(dá)減少和精子DCXR陽性率的下降從而引起不育患者生育能力低下；在對 Uu感染不育患者運(yùn)用抗感染治療后,精子DCXR蛋白表達(dá)有明顯的升高。

Uu感染可造成生精細(xì)胞從曲精小管嚴(yán)重脫落,生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，還可引起生殖系統(tǒng)中吞噬細(xì)胞增多,產(chǎn)生一系列氧自由基與過氧化產(chǎn)物,誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡[11-12]。本研究結(jié)果顯示Uu陽性不育組的精子凋亡率高于與Uu陰性不育組，經(jīng)過Uu 敏感的抗生素治療后，Uu陽性不育組的精子凋亡率明顯低于治療前。說明Uu代謝產(chǎn)物和一系列氧自由基對精子具有毒害作用，可誘導(dǎo)精子發(fā)生凋亡，在對 Uu感染不育患者運(yùn)用抗感染治療后,精子凋亡率有明顯的降低。

同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示精子DCXR蛋白表達(dá)量和精子DCXR陽性率分別與精子凋亡率呈負(fù)相關(guān)性，結(jié)果說明精子DCXR蛋白的表達(dá)可能還發(fā)揮了其雙羰基還原酶的活性，能夠清除Uu感染后精漿中的某些毒性物質(zhì), 對精子起一定的保護(hù)作用，促進(jìn)精子的成熟并減少精子凋亡率。

從結(jié)果可知，Uu感染可引起附睪功能紊亂導(dǎo)致精子蛋白DCXR表達(dá)量降低，Uu 還可通過其代謝產(chǎn)物和氧自由基誘導(dǎo)精子發(fā)生凋亡導(dǎo)致精子凋亡率增高，從而引起男性不育；同時(shí)，精子DCXR蛋白的表達(dá)還可能具有清除UU感染后精漿中的某些毒性物質(zhì), 對精子起保護(hù)和減少精子凋亡率的作用。Uu陽性不育者通過敏感抗生素治療后，可拮抗Uu 對精子結(jié)構(gòu)的損傷，減少精子蛋白DCXR的缺失和精子凋亡的發(fā)生，促使精子蛋白DCXR含量上升和降低精子凋亡率。本研究表明，Uu 感染引起精子DCXR蛋白的表達(dá)量減少和精子凋亡率的增高，可能Uu 感染造成男性不育的重要原因之一。檢測精子DCXR蛋白表達(dá)和精子凋亡率為男性不育癥的診斷和藥物療效的判斷提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。