楊林杰， 李旭然， 許婷， 鄭玉

1桂林醫(yī)學院藥學院藥理學教研室(廣西桂林 541004)； 2廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經科學研究所(廣東廣州 510260)

應激是抑郁癥的重要誘因[1-2]，慢性應激被廣泛應用于抑郁癥動物模型的制備。有效的抑郁癥動物模型的建立是抑郁癥的機制研究和抗抑郁藥研發(fā)的基礎。動物模型的成功率受許多因素影響[3]。為進一步探討慢性應激動物模型的建立條件，2015年10月至2017年6月，本實驗采用慢性不可預見性應激(chronic unpredictable stress，CUS)模型，研究不同日齡開始給予CUS對雄性大鼠抑郁及焦慮行為的影響，探討建立動物模型的時間因素及優(yōu)化條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選24只清潔級雄性SD大鼠,購買于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，在廣州醫(yī)科大學實驗動物中心飼養(yǎng)繁殖。實驗期間所有大鼠均可以自由飲水、攝食，明暗周期為 12 h/12 h，室溫 21～23℃，濕度50%～55%。3只/籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。

1.2 試劑和儀器 Smart 3.0行為學記錄分析軟件。膜片鉗記錄系統(tǒng)：MultiClamp700B放大器、Digidata 1440A數(shù)模轉換器為Axon品牌，USA。

1.3 方法

1.3.1 CUS大鼠抑郁癥模型建立及分組 CUS大鼠抑郁癥動物模型制備具體方法如下：出生后3周及4周雄性SD大鼠各12只分為幼齡組及長齡組，兩組按照體重隨機分為幼齡對照組、幼齡應激組、長齡對照組和長齡應激組，每組6只，3只為一籠。應激組每天接受2～3種不同的應激刺激：套管束縛(30 min)、頻閃光(30 min)、冰水游泳(4℃、5 min)、禁食(16 h)、禁水(16 h)、禁食禁水(16 h)、濕墊料單獨飼養(yǎng)(12 h)、明暗顛倒(24 h)、傾斜鼠籠(30°傾角、3 h)。共9種刺激，相同的刺激在相鄰2 d內不連續(xù)出現(xiàn)，7 d為1個循環(huán)，共持續(xù)14 d。對照組不給予任何刺激，正常進食飲水。各組分別在第0、7、14天稱量動物體重，在第7、14天進行行為學檢測。給予套管束縛應激時記錄30 min內的糞便數(shù)量。

1.3.2 蔗糖偏愛實驗 大鼠禁水3 h后，同時給予稱重后的一瓶普通飲用水和一瓶含有1%蔗糖的飲用水，2 h后交換2瓶水的位置，以便排除位置偏好對飲水偏愛的影響。所有大鼠均飲水4 h后，分別稱取普通飲用水和糖水的重量，并計算糖水的絕對攝入量(g)和相對攝入量(%)。糖水的相對攝入量(%)=糖水攝入量(g)/總攝入量(g)。觀察對照組和CUS組大鼠的蔗糖偏愛程度有無差異。

1.3.3 曠場實驗 將四壁和底面均為黑色無蓋木制方箱(長、寬、高分別為100 cm、100 cm及 40 cm)的底面劃分成20 cm×20 cm的方格。在箱子正上方安置紅外攝像頭，用于拍攝大鼠在整個曠場中活動的影像資料。實驗在安靜環(huán)境中進行，將大鼠從曠場一角小心放入，拍攝視頻記錄其5 min內活動情況。每次做完實驗后記錄糞便數(shù)量并清理箱內排泄物，以免影響下一只大鼠的行為。行為學軟件Smart 3.0分析系統(tǒng)分析大鼠的活動視頻，通過運動軌跡分析觀察大鼠5 min內在曠場中活動的總距離及在不同區(qū)域的活動時間。

1.3.4 腦片膜片鉗記錄 大鼠麻醉后斷頭取腦，分離海馬，通氧冰凍人工腦脊液(NaCl 124 mmol/L、KCl 3 mmol/L、NaH2PO41.25 mmol/L、MgCl21.5 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、NaHCO326 mmol/L以及葡萄糖10 mmol/L，通氣(95%O2/5% CO2)中振動切片機切片，厚度為400 μm。室溫下恢復1 h后于通氧人工腦脊液中進行實驗。顯微鏡下辨認TA區(qū)及CA1區(qū)錐體神經元，刺激電極置于TA區(qū)，記錄電極于CA1區(qū)錐體神經元上以全細胞模式進行記錄。

2 結果

2.1 CUS對不同日齡大鼠早期體重增長的影響不同 應激第1周，長齡和幼齡大鼠體重增長減慢。與長齡鼠相比，體重增加的減慢程度在幼齡鼠更加顯著(P<0.01)。應激第2周，長齡和幼齡大鼠體重增長減慢，減慢程度在長齡和幼齡鼠間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

A:第1周；B:第2周；*P<0.05;**P<0.01

組別第1周第2周對照組長齡56.4±2.0?57.4±2.4?幼齡55.2±1.5△56.3±4.3△應激組長齡50.4±1.030.6±1.2幼齡39.4±1.234.7±1.6

*與應激組長齡同時點比較P<0.05；△與應激組幼齡同時點比較P<0.01

2.2 CUS對不同日齡大鼠早期蔗糖偏愛的影響不同 蔗糖偏愛實驗表明， CUS應激1周可以使幼齡大鼠的蔗糖偏愛程度降低，與對照和長齡大鼠相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CUS應激1周未能改變長齡大鼠的蔗糖偏愛程度(P>0.05)。CUS應激2周使長齡和幼齡大鼠的蔗糖偏愛均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表2。

A:第1周；B:第2周；*P<0.05,**P<0.01

2.3 CUS對不同日齡大鼠早期曠場行為的影響不同 與長齡大鼠相比，幼齡大鼠的曠場行為更早出現(xiàn)抑郁樣行為。CUS應激1周使幼齡大鼠中央區(qū)時間減少(P<0.05)，而長齡大鼠差異無統(tǒng)計學意義。應激2周可使長齡和幼齡大鼠曠場中運動距離和中央區(qū)時間均減少(P<0.05)。見圖3、表3。

組別第1周第2周對照組長齡78.0±2.677.0±3.6?幼齡76.4±2.9△76.9±1.7△應激組長齡77.9±1.770.8±2.9幼齡69.9±1.8??63.6±1.8

與應激組長齡同時點比較*P<0.05，**P<0.01；△與應激組幼齡同時點比較P<0.05

2.4 CUS應激早期不同日齡大鼠曠場中糞便數(shù)量不同 CUS應激1周，幼齡大鼠在曠場實驗時的糞便數(shù)量較對照顯著增加(P<0.05)，長齡鼠的糞便數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CUS應激2周后，長齡和幼齡大鼠在曠場實驗中的糞便數(shù)量均顯著增加(P<0.05)。見圖4、表4。

A、C:第1周；B、D:第2周;*P<0.05

*與應激組長齡同時點比較P<0.05；△與應激組幼齡同時點比較P<0.01

A:第1周；B:第2周;*P<0.05,**P<0.01

組別第1周第2周對照組長齡2.6±0.92.0±0.6?幼齡2.7±0.9△2.4±0.8△△應激組長齡2.9±0.74.9±1.1幼齡4.9±1.25.3±1.3

*與應激組長齡同時點比較P<0.05；與應激組幼齡同時點比較△P<0.05，△△P<0.01

2.5 CUS應激早期不同日齡大鼠束縛過程中糞便數(shù)量不同 CUS應激1周后，幼齡大鼠在束縛過程中的糞便數(shù)量顯著多于長齡大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(6.7±1.3vs2.2±0.9,P<0.05)。CUS應激2周后，幼齡和長齡大鼠在束縛過程中的糞便數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(6.3±0.7vs5.3±1.9，P<0.05)。見圖5。

A:第1周；B:第2周;*P<0.05

2.6 TA-CA1 eIPSC記錄 CA1椎體神經元中可記錄到穩(wěn)定的TA區(qū)刺激后電流(Control)，相對電流幅度為(98.1±8.8)%，且該電流可被GABAA受體阻斷劑抑制(Picrotoxin)，相對電流幅度降低為(12.8±2.6)%(P<0.01)，提示該電流為TA-CA1 eIPSC。

2.7 CUS對TA-CA1 eIPSC的抑制作用 CUS第1周后，對照組TA-CA1 eIPSC幅度在幼齡鼠和長齡鼠之間差異無統(tǒng)計學意義[(118.1±27.8)pAvs(126.5±22.6)pA,P>0.05],見圖7-A，幼齡應激組大鼠TA-CA1 eIPSC幅度小于長齡應激組大鼠[(68.1±7.5)pAvs(146.8±33.0)pA,P<0.05],見圖7-B。

3 討論

在CUS模型復制過程中，應激類型的不可預測性是模型成功的關鍵，且在制備模型過程中沒有一種應激單獨應用即可產生理想效應，也沒有一種應激是模型成功所必不可少的[4]。本研究結果表明，給予不可預見性應激后，出生3周的大鼠比出生4周的大鼠更早出現(xiàn)抑郁癥狀，提示一定范圍內年齡越小則對于應激的敏感性越高。給予應激第1周，應激組大鼠體重增長均小于對照組，其中幼齡應激組的體重增長小于長齡應激組，提示幼齡組對于應激的敏感性更高。給予應激第2周，幼齡應激組的體重增長與長齡應激組差異無統(tǒng)計學意義，提示年齡因素對應激敏感性的影響主要發(fā)生在應激早期。

蔗糖偏愛實驗可反映興趣減退，是抑郁的重要指標[5-6]。應激第1周，幼齡應激組大鼠的蔗糖偏愛程度降低，長齡應激組大鼠的蔗糖偏愛下降出現(xiàn)相對較晚，提示幼齡組對于不可預見性應激的敏感性更高，更早出現(xiàn)抑郁癥狀。曠場實驗反映動物的焦慮和抑郁水平[7-8]。應激第1周，幼齡應激組大鼠的曠場中央區(qū)時間降低，長齡應激組大鼠的曠場中央區(qū)時間下降出現(xiàn)相對較晚，提示幼齡組大鼠對于不可預見性應激的敏感性更高。糞便數(shù)量能夠反映大鼠的焦慮水平[9-11]，本研究發(fā)現(xiàn)應激1周后大鼠在曠場實驗中的糞便數(shù)量在幼齡鼠和長齡鼠之間存在差異，幼齡應激組糞便數(shù)量顯著增加，提示不可預見性應激下幼齡鼠更容易發(fā)生焦慮。束縛過程中的糞便數(shù)量同樣存在類似的現(xiàn)象，應激1周后幼齡組大鼠在束縛過程中的糞便數(shù)量較長齡組明顯增加，應激2周后兩組間的差異消失，提示不可預見性應激下幼齡大鼠更容易出現(xiàn)焦慮。

A：TA-CA1 eIPSC代表性瞬時電流曲線以及Picrotoxin的抑制作用；B：TA-CA1 eIPSC時程圖以及Picrotoxin的抑制作用；C：TA-CA1 eIPSC幅度的統(tǒng)計結果；**P<0.01

圖6 eIPSC記錄

A:對照組；B:應激組

TA-CA1突觸傳遞在抑郁癥發(fā)生中具有重要意義[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)在應激早期，幼齡對照組和長齡對照組TA-CA1 eIPSC幅度間差異無統(tǒng)計學意義，幼齡應激組TA-CA1 eIPSC幅度較長齡應激組降低，提示TA-CA1 eIPSC幅度差異可能是幼齡大鼠對于CUS更為敏感的原因。

綜上所述，幼齡大鼠對于不可預見性應激更為敏感，一定范圍內降低動物的初始應激年齡有助于動物模型的建立。本研究對于動物模型的探索有助于指導抑郁癥動物模型的建立，對優(yōu)化模型條件具有指導意義。