郭慧敏，李祎亮，劉 振

（1．天津技術產(chǎn)權交易有限公司，天津 300203；2．中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所，天津 300192；3．中國食品營養(yǎng)/安全與藥物化學國際科技合作基地，教育部工業(yè)微生物重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

重樓是百合科重樓屬（Paridis）植物的泛稱。文章所指的重樓為該屬植物云南重樓和七葉一枝花，是中國著名的藥用植物，易生長在潮濕的地方。已證實重樓的活性成分為重樓皂苷類化合物[1－2]。重樓皂苷具有廣譜抗腫瘤活性，以重樓皂苷為主的活性提取物，體內外均顯示了很好的抗腫瘤活性，在動物模型上的抑瘤率超過40%[3－5]，可通過抑制基質金屬蛋白酶阻止腫瘤的轉移[6]。也有研究證實重樓皂苷可通過緩解炎癥反應、誘導細胞凋亡和降低氧化應激反應達到抑制腫瘤生長的目的[7]。重樓皂苷I和重樓皂苷Ⅱ（PSⅡ）是重樓皂苷提取物中的主要活性成分，針對重樓皂苷I已有不少研究報道[8－9]。喜樹堿（CPT）是美國化學家Wall和Wani于1966年首先從喜樹中提取出來的一種五環(huán)吲哚生物堿，1966年首次從中國本土喜樹中分離得到。CPT具有廣譜抗腫瘤作用，被列為近年來發(fā)現(xiàn)并應用于臨床的著名植物類抗腫瘤藥之一。肺癌發(fā)病率居中國惡性腫瘤首位，近70%的肺癌患者確診時已經(jīng)為晚期，錯過了最佳治療時機，臨床上主要采用化學藥物治療，但化療藥均有明顯的毒副作用。文獻報道PSⅡ對腫瘤細胞具有很強的細胞毒作用，但在肺癌方面的研究較少。因此，本文以兩種wt EGFR類型的肺癌細胞系——人大細胞肺癌NCI－H460（H460）和人小細胞肺癌NCI－H446（H446）為模型，選擇臨床上常用的廣譜化療藥物CPT，與PSⅡ聯(lián)合用藥，研究兩種藥物是否具有協(xié)同作用，并確定含有PSⅡ和CPT的最佳配伍用藥方案，對聯(lián)合用藥方案的誘導細胞凋亡及相關凋亡網(wǎng)絡通路的作用機制進行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 AnnexinV－FITC/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），Anti－tubulin抗體（西格瑪奧德里奇中國有限公司），Anti－Bcl－2抗體、Anti－Bcl－XL抗體（天津三箭生物科技有限公司）。PSⅡ（天津士蘭科技有限公司），CPT（大連美侖生物技術有限公司），純度均大于98%。H446和H460購自中國科學院上海生物科學研究所；細胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)（含1%的青霉素－鏈霉素溶液，10%的胎牛血清）。細胞培養(yǎng)每2～3 d更換培養(yǎng)基1次。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物抑瘤實驗 PSⅡ與CPT聯(lián)合抑瘤實驗：取對數(shù)生長期的細胞，調整H460和H446細胞，細胞濃度為5×104cell/mL接種于96孔板上，每孔100μL，同時設置空白孔和對照孔。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為0．031 25、0．062 5、0．125、0．25μmol/L的化合物CPT，0．3、0．6μmol/L的化合物PSⅡ，以及不同濃度配比的CPT聯(lián)合PSⅡ（0．03125∶0．3，0．0625∶0．3，0．125∶0．3，0．25∶0．3，0．03125∶0．6，0．062 5∶0．6，0．125∶0．6，0．25∶0．6），每孔0．5μL，每個藥物濃度設置3個復孔?？瞻卓诪閮H含培養(yǎng)基不含有細胞、二甲基亞砜（DMSO）以及藥物。對照孔僅加入含相同濃度DMSO的培養(yǎng)基作用于細胞。按照以上方案藥物處理后，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL的噻唑藍（MTT）溶液20μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。棄去每孔加入100μL DMSO，37℃，放置10 min后，充分溶解，用酶標儀（492 nm，參比波長630 nm）測定各孔的吸光度（OD）值，按以下公式計算細胞抑制率。細胞存活率（%）＝（實驗組OD－空白組OD）/（對照組OD－空白組OD）×100%。IC50：半數(shù)有效抑制濃度，即細胞存活率為50%時的藥物濃度。根據(jù)MTT結果求直線回歸方程，并計算IC50值。對CPT與PSⅡ的聯(lián)合作用采用CI值法計算，應用計算機軟件CompuSyn計算，CI＜1表示兩藥聯(lián)合后具有協(xié)同作用；CI＝1表示兩藥聯(lián)合后具有相加作用；CI＞1表示兩藥聯(lián)合后具有拮抗作用。

1.2.2 細胞增殖實驗（平板克隆法測定克隆形成率）取對數(shù)生長期的各組細胞，分別用0．25%胰蛋白酶消化，然后把細胞懸浮在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中備用。將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細胞分別以每皿50、100、200個細胞的梯度密度分別接種含10 mL 37℃預溫培養(yǎng)液的皿中，使細胞分散均勻。置37℃，5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。經(jīng)常觀察，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）小心浸洗2次。加4%多聚甲醛5 mL固定細胞15 min。然后去除固定液，加適量GIMSA染色液染10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加1張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)，最后計算克隆形成率。克隆形成率＝（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%，兩株細胞分為4組，分別為空白組、加入終濃度為0．125μmol/L的CPT組、0．6μmol/L的PSⅡ組，以及兩者聯(lián)合組。

1.2.3 流式細胞儀AnnexinV－FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率 將細胞接種于6孔板，待細胞貼壁生長后分別向各實驗孔加入加入0．125μmol/L的CPT和0．3、0．6μmol/L PSⅡ單獨和聯(lián)合處理24 h和48 h。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞；將各孔培養(yǎng)液的上清和收集的底部細胞懸液混合，放入離心機以1 000 r/min離心收集細胞。用PBS溶液洗細胞3次后將細胞團塊分散于細胞凋亡檢測緩沖液中，在避光條件下向細胞懸液中分別加入Annexin V－FITC和PI，室溫孵育15 min后用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。重復實驗3次。

1.2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達 使用Western blot法，研究PSⅡ與CPT聯(lián)合用藥于體外培養(yǎng)肺癌細胞株的分子藥理學機制。將兩種肺癌細胞按5×104cell/mL的細胞數(shù)量接種于10 mL平皿中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分組加入終濃度為0μmol/L（用0．5%DMSO代替）、0．125μmol/L的CPT和0．3、0．6μmol/LPSⅡ，以考察單獨和聯(lián)合用藥，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書提取蛋白，采用BCA法檢測并調整各組蛋白的濃度。將等量的蛋白溶液置于12%的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離，濕法轉移蛋白條帶至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉（PBST液稀釋）l h，一抗4℃孵育過夜；二抗室溫孵育1 h，PBST漂洗3次，每次10 min。加顯色底物孵育后，凝膠成像儀采集圖像。Bandscan 5．0凝膠分析系統(tǒng)分析顯影條帶灰度確定蛋白相對表達量。

1.2.5 統(tǒng)計分析方法 采用GraphPad Prism5軟件統(tǒng)計分析作圖，所有的數(shù)據(jù)采用（x±s）或者百分比，多組間比較采用單因素方差分析方法，組間兩兩比較采用Dunnett’s檢驗，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 PSⅡ聯(lián)合CPT的細胞毒作用 有研究表明PSⅡ對H460和H446細胞的IC50低于1μmol/L，筆者為了更好地分析PSⅡ聯(lián)合CPT的效果，分別以CPT單獨或CPT和PSⅡ聯(lián)合應用于上述兩種細胞株，考察了其細胞毒作用。肺癌細胞采用不同濃度的CPT（0、0．031 25，0．062 5、0．125，以及0．25μmol/L）和PSⅡ（0．3和0．6μmol/L）單獨和聯(lián)合處理48 h，細胞存活率由MTT測得，見圖1。結果顯示，藥物處理的細胞相對DMSO組的細胞存活率及CPT單獨使用對肺癌細胞有細胞毒活性并呈現(xiàn)劑量依賴性，當PSⅡ聯(lián)合CPT時，對肺癌細胞的細胞毒作用強于單獨應用CPT。PSⅡ聯(lián)合CPT對H460和H446細胞的CI＜1，表明具有協(xié)同作用；PSⅡ增加了CPT對肺癌細胞的敏感性。在隨后的抑瘤分子機制研究中對H460和H446細胞應用的劑量為0．6 μmol/LPSⅡ+0．125μmol/LCPT。

2.2 PSⅡ聯(lián)合CPT的抗細胞增殖作用 肺癌細胞采用CPT（0．125μmol/L）和PSⅡ（0．6μmol/L）單獨或聯(lián)合處理48 h后，聯(lián)合用藥效果明顯優(yōu)于單獨用藥組，PSⅡ聯(lián)合CPT對H460和H446細胞的CI＜1，表明兩種藥物具有協(xié)同抑瘤作用。見圖2。

2.3 PSⅡ聯(lián)合CPT誘導肺癌細胞凋亡的作用 采用Annexin V－FITC和PI雙染細胞，應用流式細胞儀測定細胞凋亡。分別以PSⅡ（0～6μmol/L）、CPT（0．125μmol/L）、PSⅡ－CPT（0．6～0．125μmol/L）處理肺癌細胞48 h后，收集細胞，Annexin V－FITC和PI雙染，Annexin V－FITC陽性和PI陰性的細胞為早期細胞凋亡（Q1－LR）；Annexin V－FITC和PI均陽性的細胞為晚期細胞凋亡（Q1－UR）；Annexin VFITC和PI均陰性的細胞為正?；罴毎≦1－LL）。聯(lián)合用藥之后，增加了H460、H466細胞的早期凋亡，尤其是對H466細胞，凋亡比例為（70．10±3．44）%，見圖3。而對H460細胞，PSⅡ和CPT聯(lián)合后顯著增加了晚期凋亡。

圖1 PSⅡ和CPT聯(lián)合作用對H460、H446細胞的細胞毒作用Fig.1 Cytotoxicity of PSⅡcombined CPT in H460 and H446 cells

圖2 PSⅡ和CPT單獨或聯(lián)合作用于H460和H446細胞的平板克隆形成實驗結果Fig.2 Experimental result of PSⅡand CPT combined or single used in H460 and H446 cellsby flat plateclone formation test

2.4 PSⅡ聯(lián)合CPT對肺癌細胞凋亡相關信號通路的作用 為了進一步研究PSⅡ聯(lián)合CPT的抑瘤協(xié)同作用機制，采用Western blot方法檢測了抗凋亡蛋白B淋巴細胞癌（Bcl）－2和Bcl－XL的表達情況，同時對蛋白激酶B（AKT）、細胞外信號調節(jié)酶（ERK）和p38 MAPK磷酸化蛋白的表達進行了研究。結果表明，這幾種蛋白參與細胞凋亡過程。對H460而言，PSⅡ聯(lián)合CPT能明顯上調p38 MAPK磷酸化和ERK磷酸化的表達，對AKT磷酸化無明顯作用，并下調了Bcl－2和Bcl－XL蛋白的表達。對H446細胞而言，PSⅡ聯(lián)合CPT后上調了AKT、p38 MAPK和ERK的表達，并下調了Bcl－2蛋白的表達，對Bcl－XL無明顯作用，見圖4。

圖3 PSⅡ和CPT聯(lián)合給藥對H460和H446細胞的誘導凋亡作用Fig.3 Effect of PSⅡcombined CPT treatment indnced apoptosis in H460 and H446 cells

3 討論

食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準了一些分子靶向藥物如吉非替尼用于治療晚期NSCLC患者，并確有良好的療效，但是由于這些靶向藥物分子的作用局限性、價格高以及使用一段時間后會產(chǎn)生耐藥，臨床上化療藥物依然在治療肺癌晚期患者占據(jù)主要地位，如CPT類藥物。聯(lián)合用藥是治療疾病過程中常采用的方式，聯(lián)合用藥產(chǎn)生的協(xié)同作用可顯著提高藥物的療效[10－11]。關于CPT聯(lián)合其他類藥物的研究也多有報道，如聯(lián)合鬼臼毒素和雷公藤甲素對肺癌細胞系具有協(xié)同作用。前期實驗發(fā)現(xiàn)重樓與姜黃的復合物與HCPT聯(lián)合對H22肝癌模型呈現(xiàn)協(xié)同作用。重樓皂苷I、PSⅡ是該復方的主要活性成分，已有研究表明重樓皂苷I對H1299、H520、H460和H446肺癌細胞系具有很好的細胞毒作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性，重樓皂苷I聯(lián)合CPT和HCPT對不同肺癌細胞系呈現(xiàn)不同的作用取決于肺癌的種類[9]。因此，本文研究了PSⅡ聯(lián)合CPT的協(xié)同作用，結果表明PSⅡ具有化療增敏作用，與CPT聯(lián)合對H460和H446兩種肺癌細胞系具有協(xié)同作用，由于這兩種細胞是不同種類的肺癌細胞系，H460為NSCLC細胞系，H446屬于SCLC細胞。CPT作為拓撲異構酶I（Topo I）的抑制劑，能與Topo I－DNA形成復合物，從而引起DNA復制過程中DNA單鏈的斷裂，進而導致細胞的死亡。近期，對CPT作用機制進行深入研究發(fā)現(xiàn)該類化合物對多條信號通路亦有作用，包括線粒體凋亡通路、PP2A調節(jié)通路、核轉錄因子－κB（NF－κB）信號通路等[12]。PSⅡ是一種很強的細胞凋亡誘導劑，可以通過調節(jié)多種信號通路如對NSCLC的AKT通路的調節(jié)以及對SCLC的ERK通路的調節(jié)。本研究中PSⅡ在低劑量下（0．6μmol/L）并不能引起H460和H446細胞的凋亡，而CPT單獨使用劑量下能明顯誘導H460和H446細胞的凋亡比例。當PSⅡ與CPT聯(lián)合后能明顯增強兩種肺癌細胞系的凋亡細胞比例，這說明PSⅡ能增加CPT對肺癌細胞系的敏感性。

MAPK和AKT信號通路對來自細胞外的刺激敏感，AKT活化與腫瘤的發(fā)生密切相關，成為腫瘤治療過程中的一個靶點；ERK通常與細胞的增殖和生長相關；而p38 MAPK是細胞應激過程中產(chǎn)生的，與細胞的死亡密切相關[8，13－15]。本研究發(fā)現(xiàn)PSⅡ聯(lián)合CPT能明顯上調p38 MAPK磷酸化和ERK的表達，對AKT磷酸化在不同細胞中作用不同。以上研究結果表明PSⅡ聯(lián)合CPT對NSCLC和SCLC的作用機制不同，調節(jié)不同的信號通路。

線粒體是腫瘤發(fā)生過程中一種重要的調節(jié)劑，它參與細胞死亡、氧化應激、代謝等過程[16]。許多研究發(fā)現(xiàn)線粒體積極參與到細胞凋亡的關鍵環(huán)節(jié)，包括調節(jié)凋亡信號通路、線粒體膜電位的缺失、促凋亡因子細胞色素C的釋放等[17]。Bcl－2家族是細胞凋亡的調節(jié)劑，并在細胞凋亡過程中起到重要作用，能改變線粒體膜電位。Bcl－2家族蛋白可分為兩個亞族，其中一個是抗凋亡蛋白包括Bcl－2和Bcl－XL[18]。本文的研究結果表明PSⅡ聯(lián)合CPT作用于H460細胞后，Bcl－2和Bcl－XL的表達降低。由此推測PSⅡ增敏CPT對H460和H446細胞的作用機制可能是影響線粒體信號通路產(chǎn)生的細胞凋亡。

研究結果顯示PSⅡ可以作為化療藥物CPT的增敏劑，呈現(xiàn)協(xié)同作用的分子機制是抑制細胞的增殖和誘導細胞凋亡，主要的作用通路為激活p38 MAPK信號通路，同時激活AKT和ERK磷酸化蛋白的表達。本研究為PSⅡ成為化療藥物治療肺癌的增敏劑提供了實驗基礎，PSⅡ聯(lián)合CPT有望成為治療肺癌的新治療策略。

圖4 PSII聯(lián)合CPT對H460和H446細胞中Akt、ERK和p38 MAPK磷酸化蛋白以及抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的作用Fig.4 Effect of PSIIcombined with CPT in Akt,ERK and p38 MAPK phosphorylated protein and anti-apptotic protein Bcl-2 and Bcl-XL in H460 and H446 cells